多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆-《江苏农业科学》(2020年18期).docx

龙源版权所有 多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆作者：石盼盼 谢文佳 刘燕 王璐 陈蕾 郝莉花来源：《江苏农业科学》2020年第18期 摘要：采用多重实时荧光PCR技术，对大豆筛选基因35S启动子（cauliflower mosaic virus，CaMV 35S）、NOS终止子（nopaline synthase，NOS）和内源基因Lectin设计合成了多对检测引物和探针，在筛选各基因合适的检测引物和探针的基础上，摸索引物组合和扩增条件，最终确定合适的探针引物组合和试验条件，建立转基因大豆快速初筛技术。该方法可在1 h内同时完成对转基因大豆3个基因片段的实时荧光PCR检测。方法特异性强，灵敏度高，可用于大豆转基因成分的快速检测，大大提高检验效率，可为消费者的食品安全及我国大豆的进出口检验提供有效的技术支持。 关键词：三重实时荧光聚合酶链式反应PCR;大豆;转基因成分;特异性;灵敏度 中图分类号：S565.101文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2020）18-0077-04 收稿日期：2019-11-12 基金项目：河南省科技攻关计划（编号：172102310724）。 作者简介：石盼盼（1987—），女，河南洛阳人，硕士，工程师，主要从事食品安全质量检测研究。E-mail：523150920@。 大豆营养丰富，为人类提供优质的蛋白质和油脂，是我国重要的粮食油料兼用作物，也是重要的饲料来源[1-2]。我国大豆及相关产品的消费量在国际上一直名列前茅。以2017年为例，我国消费大豆油1 740万t，占全球消费总量的309%;消费豆粕7 407万t，占全球消费总量的317%。随着健康饮食方式的引导，大豆消费水平不断上升，但国内种植量增长缓慢。近几年来，我国主要从美国、阿根廷等国家进口大豆[3-4]。在进出口贸易中大豆及其产品转基因成分是常检项目。转基因大豆产品因其安全性备受争议，严重影响了人们对大豆的消费热情。目前，市场监督管理及进出口检验检疫部门着重于研究开发更为科学高效的转基因大豆检测技术，保证非批准转基因大豆及其产品无法进入我国[5]。 我国农业农村部已经批准美国孟山都等公司的多种转基因大豆进口到我国。我国自主研发的转基因大豆品种也已经实现产业化。我国转基因育种技术的发展进一步促使基因产品检测技术的发展升级[6]。目前我国国家标准中对转基因大豆的检测主要以聚合酶链式反应（PCR）法为主。如《农业部2630号公告-15-2017转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆SHZD32-1及其衍生品种定性PCR方法》[7]和国家标准GB/T 33526—2017《转基因植物产品数字PCR检测方法》[8]。在研究领域多种基于分子生物学的检测技术不断涌现，但应用性方面还有待研究推广[9-14]。其中，魏霜等利用多重串联式PCR基因碟片技术用于转基因大豆GTS40-3-2的检测[15]，即利用多重PCR和巢式荧光定量PCR检测GTS 40-3-2的多个外源基因和内源基因，实现了转基因的高通量检测，但该方法技术要求高，且检测方法主要是普通PCR技术，检测结果须要进一步凝胶电泳分析，过程相对复杂。本试验研发的三重实时荧光PCR法可以达到多项国家标准和进出口行业标准的基因检测限，并且1次反应能同时准确检测有无转基因大豆的CaMV 35S、NOS和Lectin 3个基因片断，试验时间短，操作简单，方便技术推广应用。 1材料与方法 1.1试验材料与试剂 大豆转基因成分阳性质控样品、大豆转基因成分阴性质控样品，均购自中国检验检疫科学研究院测试评价中心;实时荧光PCR扩增引物和探针（表1），均购自生工生物工程（上海）股份有限公司;苯酚-三氯甲烷-异戊醇混合液（体积比为25 ∶24 ∶1）、2×PCR MasterMix，均购···试读结束