1株绵羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及致病性研究-《江苏农业科学》(2017年7期).docx

龙源版权所有 1株绵羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及致病性研究作者：李基棕 李文良 毛立 郝飞 杨蕾蕾 张纹纹 江杰元来源：《江苏农业科学》2017年第07期 摘要：为确定导致绵羊细菌性感染死亡的病原，从送检病死绵羊肺脏中分离纯化出1株细菌，并对其进行培养特性观察、生化反应、PCR鉴定、药敏试验和动物致病性试验。结果显示，分离纯化的细菌为革兰氏阴性短杆菌，经生化反应和PCR鉴定为溶血性曼氏杆菌；该细菌对庆大霉素、头孢噻肟高度敏感；对青霉素、四环素、红霉素、利福平、卡那霉素、恩诺沙星和大观霉素耐药；将1×109 CFU/mL菌液10倍系列稀释后感染6～8周龄小白鼠，该细菌对小白鼠的半数致死量为1×106.2 CFU/mL；死亡动物的剖检病变与发病绵羊类似，并从病变器官内分离到细菌。本研究为进一步探讨溶血性曼氏杆菌的致病机理奠定了基础。 关键词：绵羊；溶血性曼氏杆菌；分离鉴定；致病性 中图分类号： S855.1+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）07-0156-03 溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica，Mh）别称溶血性巴氏杆菌，该菌属于机会致病菌，可长期寄生于牛、绵羊、山羊等反刍动物及其他动物上呼吸道[1-2]。当受到外界环境骤变、长途运输等刺激出现应激反应，动物机体抵抗力下降，病菌可趁机侵入从而致病，病毒和支原体感染如绵羊肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、副流感病毒等，可使得机体对溶血性曼氏杆菌更易感[3-4]。它能够引起牛、羊肺炎，新生羔羊的急性败血症，给养牛业和养羊业带来较大的经济损失[5]。 2015年底，安徽宣城某养羊场发生疫情，死亡率达10%以上，发病羊主要表现为咳嗽、喘气、流鼻涕等呼吸道症状，剖检病变主要为肺脏出血、充血、水肿、实变。从发病羊肺脏中分离出1株菌株，通过生化鉴定和PCR鉴定，确定该分离株为溶血性曼氏杆菌。 1材料与方法 1.1主要试剂 绵羊鲜血琼脂培养基、微量生化反应管、抗菌药物药敏纸片均购自浙江杭州微生物試剂公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker等均购自北京全氏金生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。 1.2试验动物 6～8周龄BALB/c小鼠，购自扬州大学比较医学中心。 1.3病原的分离 无菌采集绵羊肺脏组织块接种于鲜血琼脂平板上，培养24 h后，挑取单个菌落进行纯化。挑取纯化的菌落涂片进行革兰氏染色镜检。 1.4生化试验 将纯化的菌落按照常规方法接种于葡萄糖、麦芽糖、甘露醇等生化鉴定管中，置于37 ℃恒温培养箱中培养，观察其生化特性。 1.5PCR鉴定 参照Alexander等基于lkt基因设计的溶血性曼氏杆菌特异性引物（LktF：5′-GCAGGAGGTGATTATTAAAGTGG-3′；LktR：CAGCAGTTATTGTCATACCTGAAC）[4]进行PCR扩增，预期扩增片段大小为206 bp。 以纯培养细菌的染色体DNA为模板，PCR反应体系为25 μL：Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板2 μL，引物P1、P2各1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 1 μL，无菌水18 μL。反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后取PCR产物于1.2%的琼脂糖凝胶中电泳检测。将目的片段切胶回收，并与pMD19-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，经鉴定正确后送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。1.6耐药性试验 采用纸片扩散法进行药敏试验，将分离的溶血性曼氏杆菌均匀涂布于鲜血琼脂平板上，然后将药敏纸片紧贴于琼脂表面，37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径。 1.7小鼠致病性试验 将分离纯化的菌株接种于含犊牛血清的LB液体培养基中，37 ℃培养24 h，取菌液10倍系列稀···试读结束