酶联免疫吸附法检测鸡肉中林可霉素-《湖北畜牧兽医》(2010年3期).docx

龙源版权所有 酶联免疫吸附法检测鸡肉中林可霉素作者：何方洋,万宇平,何丽霞,罗晓琴来源：《湖北畜牧兽医》2010年第03期 摘要:通过对林可霉素分子结构进行改造,制备了半抗原及人工抗原免疫动物,制备了林可霉素的单克隆抗体。该方法的灵敏度为0.2μg/L,对林可霉素的交叉反应率为100%,对克林霉素、红霉素、泰乐菌素、链霉素、卡那霉素的交叉反应率均小于1%,以20μg/kg和40μg/kg添加水平的鸡肉样本回收率范围为83.5%～96.5%,变异系数小于15%,表明该方法快速、灵敏、可靠,适合用于检测鸡肉中的林可霉素残留限量检测的要求。 关键词:酶联免疫技术;林可霉素;鸡 中图分类号:TS207.3文献标识码:A文章编号:1007-273X(2010)03-0007-03 林可霉素(lincomycin)又称洁霉素,是由链霉菌发酵产生的林可酰胺类抗生素,有较强的抑菌活性,其结构式如图1: 林可霉素残留通过食物链进入人体后累积可以导致细菌耐药性,因此,各国都对其作出限量要求,中国农业部235号文件规定其残留限量为0.01mg/kg(鸡肉),日本规定其残留限量为0.02mg/kg(鸡可食用内脏)。 林可霉素残留量的常规检测方法主要有高效液相色谱技术[1,2]、高效液相色谱串联质谱[3]、液相色谱/质谱联用技术(LC-MS/MS)[4-6]、氮磷气相色谱检测法[7]、薄层色谱[8]、气相色谱[9]等,由于复杂的仪器设备和繁琐的过程以及对检验人员的高技能要求,不适合现场监控和大量样本的筛查,本文的目的就是建立一种快速灵敏地检测鸡肉中林可霉素残留的酶联免疫吸附方法(ELISA)。 1材料与方法 1.1试剂与药品 林可霉素标准品:购自中国兽医药品监察所;牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、辣根过氧化物酶(HRP):购自Sigma公司;其他常规试剂,除特别注明外均购自北京化学试剂公司。 1.2主要仪器 酶标仪:雷伯MK3(芬兰);酶标板:Costar公司产品;离心机TDL-40B:上海安亭。 1.3实验动物 8周龄的雌性Balb/C小鼠,共6只。 1.4林可霉素半抗原、完全抗原的合成及单克隆抗体的制备 1.4.1林可霉素半抗原合成将林可霉素通过琥珀酸酐法合成林可霉素-琥珀酸酐半抗原,具体步骤如下:称取2.3g林可霉素和0.5g琥珀酸酐放入50mL圆底烧瓶中加无水吡啶至完全溶解,70℃加热搅拌反应24h。反应结束后,减压蒸馏去溶剂,残余物用丙酮洗涤数次,用乙酸乙酯-正己烷使其结晶,得半抗原林可霉素-琥珀酸酐。具体合成技术路线如图2。 1.4.2林可霉素免疫原及包被原的合成将林可霉素半抗原分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)采用混合酸酐法偶联,得到林可霉素免疫原与包被原。 1.4.3动物免疫及单克隆抗体的制备用200μg的林可霉素免疫原与等量FCA混合制成乳化剂,颈背部皮下多点注射。二免和三免时,将FCA换成FIA,剂量和方法同上,每次免疫间隔时间为2周,三免后第7天,小鼠尾部静脉采血,室温静置1h,4℃过夜,12 000r/min离心10min,收集血清,4℃保存,用间接ELISA法测定血清效价,待效价较高时,按照150mg/只的剂量腹腔注射加强免疫。3d后取小鼠脾脏进行细胞融合,以有限稀释法筛选阳性克隆,并按照常规方法制备腹水抗体,用饱和硫酸铵法纯化后备用。 1.5酶联免疫方法的建立 1.5.1采用方阵滴定法确定包被抗原与抗体的最佳工作浓度每孔加入100mL最佳工作浓度的包被抗原包被酶标板,37℃温育2h。洗涤液洗涤,用封闭液37℃条件下封闭2h,洗涤,干燥备用。向包被有包被抗原的酶标板微孔中加入林可霉素标准品溶液或鸡肉样品溶液50mL,再加入林可霉素单克隆抗体溶液50mL,用盖板膜封板,25℃反应30min,洗涤液洗涤4~5次拍干。再加入100mL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体溶液,25℃反应30min,重复洗板,每孔再加入100mL TMB系统底物液,25℃显色15min,每孔加入50mL 2mol/L硫酸,在酶标仪测定450nm处各孔OD值。 1.5.2标准曲线的制作以1.5.1步骤所测获得的林可霉素的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%,得到百分吸光度值,以林可霉素标准品浓度(mg/L)的半对数值(lgC)为x轴,百分吸光度值为y轴,绘制标准曲线图。 1.5.3检测单克隆抗体与其他同类药物的交叉反应率测定方法同1.5.1,但抑制物分别为倍比浓度的克林霉素、红霉素、泰乐菌素、链霉素、卡那霉素,根据抑制曲线计算抑制抗原抗体结合50%时的各竞争物的浓度之比。计算公式如下: 交叉反应率(%)=(引起50%抑制