一种简单高效制备纯化TaqDNA聚合酶的方法[发明专利].pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局 *CN102816786A* (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 102816786 A (43)申请公布日 2012.12.12 (21)申请号 201210165241.2 C12N 9/12 (2006.01) (22)申请日 2012.05.25 (71)申请人 湖北大学 地址 430062 湖北省武汉市武昌区学院路 11 号 (72)发明人 钟星 翟超 马立新 余晓岚 严红 蒋思婧 (74)专利代理机构 武汉金堂专利事务所 42212 代理人 丁齐旭 (51)Int.Cl. C12N 15/70 (2006.01) C12N 15/54 (2006.01) 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 权利要求书1 页 说明书5 页 附图3 页 (54)发明名称 一种简单高效制备纯化TaqDNA 聚合酶的方 法 (57)摘要 本发明提出了一种简单高效制备纯化TaqDNA 聚合酶的方法。该方法操作步骤为：1）构建 TaqDNA 聚合酶表达载体pET-30aTAQ ；2）在卡那 霉素低盐LB 平板上转化TaqDNA 聚合酶表达载体 pET-30aTAQ 得到菌株BL21 （DE3）/pET-30aTAQ ； 3）接种到卡那霉素低盐LB 液体培养基中振荡培 养到OD600=0.4 ～0.9 ；4）IPTG 诱导2 ～24 小时； 5）离心收集培养基上清；6）将上清80 ～100℃加 热10 分钟后0 ～-20℃冰浴1 分钟；7）再用离心 收集上清；8）酶液经检测后冻存即为成品酶。本 发明的具有突出优点，纯化步骤仅需要两步离心， 一步热循环，方法简单。免除了传统方法的破菌 裂解程序和后续繁杂的纯化步骤。提高了TaqDNA 聚合酶的纯度，减少了污染，节约了制备成本，缩 A 短了生产周期，可以应用于连续在线固定化生产 6 TaqDNA 聚合酶。 8 7 6 1 8 2 0 1 N C CN 102816786 A 权 利 要 求 书 1/1 页 1. 一种简单高效制备纯化Taq DNA 聚合酶的方法，其特征在于步骤为： 1）．构建Taq DNA 聚合酶表达载体pET-30aTAQ，pET-30aTAQ 为利用novagen 公司载体 pET-30a（目录号69909-3），在ECOR V 酶切位点插入Taq DNA 聚合酶基因得到；Taq DNA 聚 合酶基因编码产物UniProtKB/Swiss-Prot 编号为P19821.1 ； 2）．在含有终浓度25-100ug/ml 的卡那霉素低盐LB 平板上转化Taq DNA 聚合酶表达 载体pET-30aTAQ 得到菌株BL21 （DE3）/pET-30aTAQ，37℃培养箱培养过夜； 3）. 接种到补加终浓25 ～100ug/ml 的卡那霉素低盐LB 液体培养基中振荡培养到 OD =0.4 ～0.9 ； 600 4）. 培养物中加入2 ～5mM 的IPTG 诱导7 ～24 小时； 5）. 收集培养物，以相对离心力375 ～12000g 离心5 分钟小心收集培养基上清； 6）. 将上清80 ～100℃加热10 分钟后0 ～-20℃冰浴1 分钟； 7）. 以相对离心力375 ～12000g 离心5 分钟小心收集上清； 8）. 酶液经检测后冻存即为成品酶。 2