分子生物学实验.ppt

分子生物学实验;实验目录;实验一 植物基因组DNA提取;4.核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸通常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为DNA和RNA，在真核生物中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质和核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。;5. 植物基因组DNA的提取程序： （1）破碎组织 （2）破坏细胞膜 （3）去除杂质 （4）沉淀基因组DNA;6. DNA的检测方法 （1）紫外分光光度法 （2）电泳检测DNA的质量 ;本实验是通过SDS法提取拟南芥基因组DNA。; 1.通过SDS提取拟南芥基因组DNA; 2.为从拟南芥基因组DNA克隆目的基因作准备;仪器及耗材： 研钵、微量移液器及吸头、EP管、台式离心机。 材 料： 拟南芥小苗 试 剂： DNA Extract Buffer (0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5); 70%乙醇；酚；氯仿；异丙醇;RNase ;实验步骤;9.在溶解DNA中加入3-5 μl RNase，37℃消化2-3h； 10.补充ddH2O至总体积400 μl ，加入等体积的酚/氯仿，混匀； 11.12000rpm，5min（RT）， 12.取上清，加入1/10体积的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，-20 ℃放置10min; 13.12000rpm，4 ℃离心10min； 14.去上清，70%乙醇洗涤沉淀,12000rpm，4 ℃离心5min; 15.去上清，沉淀干燥后，加入20 μl ddH2O溶解DNA； 16.分光光度计法检测DNA的浓度和纯度。;实验报告分析;注意事项;思考题;实验二 PCR克隆目的基因;PCR原理 FLASH演示;PCR技术发展; 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。 Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学。 ; Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是： ①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。 ②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。 Klenow这些缺点给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 ;; Pfu DNA Polymerase Pfu DNA 聚合酶是已知保真度最高的聚合酶，来自于Pyrococcus furiosis 菌株，不仅具有掺入反应迅速及热稳定性高的优点，更是当前市场上所有DNA聚合酶中掺入出错率最低的一种。 优点：Pfu具有3’ →5’校阅功能，其错配率分别仅为10-7。 缺点：效率低，扩增片段较短;;PCR反应体系组成;1. 模板;2. 引物;引物设计原则;4 种 dNTP;Mg2+;DNA 聚合酶;;反应缓冲液;缓冲液 10 mmol/l Tris.Cl 提供适合反应的pH值（pH 8.4） 50 mmol/l KCl 促进引物退火 10 μg/ml 明胶或血清白蛋白 为Taq酶的保护剂;PCR反应主要参数： 1. 预变性：94°C， 3--5min 2. 变性： 94°C，30s-1min 3. 复性： 56 °C，20s--2min 4. 延伸： 72 °C，30s--3min 5. 总延伸：72 °C， 10min;预变性和变性;退火;延伸;循环次数; 1.通过PCR从拟南芥基因组中扩增目的基因片段 2.学习PCR仪等仪器的使用;材料：拟南芥基因组DNA 器材：移液器及吸头，PCR 管， PCR仪，台式离心机。 ;所需试剂;实验步骤;2. 将PCR管放置到PCR仪中，盖好盖子 3. 用94oC预变性3-5分钟；94oC变性1分钟，58oC退火1 分钟, 72oC延伸2 分钟, 30个循环；最后一轮循环结束后, 于72oC下保温10 分钟， 4. 终止反应，从PCR仪取出PCR管，放置4oC存; 1.PCR 非常灵敏, 尽可能避免污染。吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂； 2.加试剂前, 应短促离心10 秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面； 3.应设含除模板DNA 所有其它成分的负对照。;思考题;实验三 PCR产物琼脂糖凝胶电泳;一、实验原理;影响DNA 迁移速率因素;;琼脂糖浓度