碱性磷酸酶比活力测定.pptxVIP

碱性磷酸酶比活力的测定第一页，共十二页。一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法2.掌握碱性磷酸酶比活测定的方法第二页，共十二页。二、原理（一）、比色分析法1. 物质的颜色和波长：可见光：波长（λ）400—760nm紫外光：λ小于400nm红外光：λ大于760nm光的互补示意图2. 溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色，是由于不同的有色物质有选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。第三页，共十二页。3. 物质浓度，液层厚度与光吸收的关系（Lambert--Beer定律）：当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D）与溶液的浓度（C），液层的厚（L）以及入射光的强度（I0）有关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定律。第四页，共十二页。4. 待测溶液浓度的计算：（1）标准管法：在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D）值，然后计算：C未知 =（D未知/D标准）×C标准（2）标准曲线法：分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度（D）值。在一定浓度范围内，溶液浓度（C）与其光密度（D）之间呈直线关系。以各管D为纵坐标，C为横坐标，绘制标准曲线。待测溶液D值测出后，在曲线上查出C。第五页，共十二页。（3）消光系数法：1%浓度，1cm厚度溶液中测得：K = E1cm1%或１克分子浓度，１cm厚度溶液中测得：K = ξC = D/E1cm%, 或 C = D/ξ常用于紫外吸收法测定蛋白质，核酸含量，二者分别在280nm和260nm处有最大吸收，其消光系数可查到，在同样条件下，测定待测溶液的光密度, 带入上式即可求得C。第六页，共十二页。（二）、酶活力在37?C下，以5mmol/L pNPP为底物，在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 ?mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。第七页，共十二页。酶活性测定前处理1、2号样品稀释50倍（用洗脱液稀释）3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释）4号样品不稀释（用洗脱液稀释）蛋白浓度测定前处理1、2号样品稀释100倍（用洗脱液稀释）3号样品稀释20倍（用洗脱液稀释）4号样品对倍稀释（用洗脱液稀释）第八页，共十二页。12支试管，1-4做两组平行测定管，01-04作为空白对照管 号空白（01-04）1-12-23-34-45 mM pNPP(mL)各0.2mL Na2CO3-NaHCO3 (mL)各管加入1.0 mL 20 mmol/L MgCl2 (mL)各管加入0.2 mL H2O (mL)各0.50mL混匀，37℃，5分钟 酶液（mL）/各0.1mL37℃，精确反应10分钟 0.1 mol/L NaOH (mL)各管加入2.0 mL 酶液（mL）0.1mL OD 405 nm第九页，共十二页。蛋白浓度测定1. 测定100 μg/mL牛血清白蛋白溶液的OD值；2. 将稀释后的样品在280nm下测定吸光度；3. 以洗脱液作空白。蛋白浓度按下式计算：第十页，共十二页。数据处理单位时间0.1mL酶液催化产物量计算：克分子消光系数法即C未知＝OD/(8.8?103)第十一页，共十二页。计算：式中：A为稀释倍数，B为由消光系数法计算得的pNP ?mol数，t为反应时间，C为测得的蛋白mg数，V1为测定酶活力所用的酶量(mL数) V2为测定酶活力所用的酶量(mL数)酶的比活力（U/mg）＝ 酶活力(U/mL)/ 蛋白浓度(mg/mL)纯化倍数=各步比活力/第一步比活力得率%=各步总活力? 100/第一步总活力 A第十二页，共十二页。