OD值与吸光度值.docx

OD 值 朗伯——比尔（Lambert －beer ）光吸收定律： A＝－lgT＝εb c A——吸光度，又称光密度“O.D。” T——透光度， T＝I / I。， I。——为照射到吸收池上的光强，I——为透过吸收池的光强。 ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L·mol －1·cm －1）。 b——样品光程（cm ），通常使用 1.0cm 的吸收地，b=1cm 。C——样品浓度（mol/L）。 由上式可以看出：吸光度A 与物质的吸光系数“ε和”物质的浓度“C成”正比。 DNA 和 RNA 的 OD 值 原理 嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在 240~290nm 的紫外波段有一强烈的吸收峰，因此核酸具有紫外吸收特性。DNA 钠盐的紫外吸收在 260nm 附近有最大吸收值（图3-25），在230nm 处为吸收低谷，其吸光率（absorbance）以A260 表示， A260 是核酸的重要性质，RNA 钠盐的吸收曲线与DNA 无明显区别，蛋白质在280nm 处有 最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm 处，对于纯的核酸溶液，测定 A260 ，即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量，核酸的比吸光系数是指浓度为1μg／mL 的核酸水溶液在 260nm 处的吸光率，天然状态的双链 DNA 的比吸光系数为 0.020，变性 DNA 和 RNA 的比吸光系数为 0.022。据朗波－比尔光吸收定律A＝-lgT＝εbc知，c＝A/ε，b 而 b 通常为 1cm ，所以，通常以1OD 值相当于 50μg／mL 双螺旋DNA ，或 40μg／mL 单螺旋DNA （或RNA ），或 20μg／mL 寡核苷酸计算。 纯度 DNA 和 RNA 的纯度可以通过测定 260nm ，230nm 和 280nm 的紫外吸收值来测定，纯的DNA OD260 ／280 在1.8-1.9，OD260 ／230 应大于2.0，纯的RNA OD260 ／280 在1.9-2.0， 如果 DNA 比值高于 1.8-1.9，可能有 RNA 没有去除干净，如果 DNA 比值小于 1.8-1.9，可 能含有酚或者蛋白质（RNA 中含有酚或者蛋白质比值也会降低），若 OD260 ／230 小于 2.0 说明有残存的盐或小分子杂质污染。 浓度 DNA 和 RNA 的量，据朗波－比尔光吸收定律 A＝-lgT＝εbc知测量样品的浓度为 c＝ A/εb，又知 ε＝0.020，在 b＝1cm 的情况下，c＝A/（0.020×1）＝50×A，则未稀释的样品的浓度为 50×A×稀释倍数（μg／mL ）＝50×A×稀释倍数/1000（mg ／mL ） 注意事项： 比色杯应为石英杯，玻璃杯在此波长时读数不准。 检测时应使OD260 值在 0.15 到 1.0 之间，数值比较准确。 这种比值测定的方法仅仅适用于核酸浓度大于 0.25ul／ml 的时候，浓度小于 0.25ul／ ml 的时候测量误差较大。 既含有RNA 又含有蛋白质也可能使比值维持在1.8，这个时候要根据电泳情况鉴定是不是含有RNA ，或者测定一下是不是含有蛋白质； A260/A280 比值可提供DNA 纯度的一个参考，但 A260/A280 比值会受pH 影响。如果 未调pH ，比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值，建议在 10 mM Tris Cl, pH 8.5 中检测，此时纯净的 DNA A260/A280 比值应为 1.8-2.（0照）。 注意应使用同样缓冲液作为对 进行 OD 值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD 值。 可以在 220-330 nm 之间进行扫描，此扫描可以检测是否有其它因素影响OD 260，如在 325 nm 处有吸光值说明有污染物或比色皿不干净。) DNA 的量与 260 nm 处的吸光度值（OD 值）成正比，在引物设计时，1 个 OD 值的合成 DNA 的重量约为 33 mg 。