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2种微生物胰蛋白酶的作用性能研究 摘要：研究了2种微生物胰蛋白酶（NB115和JD8）的基本酶学特性及其对酪蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等底物的作用性能，考察了它们对脱灰裸皮的软化效果，并与2种典型的动物胰蛋白酶（DY300和PTN110）进行了比较。结果表明：四种胰蛋白酶在pH值7～9之间有较高的活力，在25～45℃范围，它们的酪蛋白和胶原蛋白活力均随温度的升高而增加；NB115和PTN110具有较高的耐温性能，JD18和DY300的耐温性能较差。它们对不同底物的作用性能有较大的差异，在相同的酪蛋白活力下，JD18有更高的胶原蛋白活力，但其无弹性蛋白活力；DY300具有相对较高的弹性蛋白活力。由于它们对皮结构蛋白的作用性能的差异，其软化皮革的柔软度和粒面紧实度有一定的差异，适合不同类型皮革的软化。 引言酶软化是用酶制剂处理脱灰后的裸皮，得到洁净、平细、有弹性、柔软的皮革的操作。软化是制革过程中不可或缺的，也是唯一难以被化学处理代替的工序动物来源胰酶在应用中存在一些缺陷。由于动物胰腺中的消化酶系复杂，酶的种类多，从猪的胰脏中可分离出胰蛋白酶、弹性蛋白酶、缓激肽酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶等多种酶微生物源胰蛋白酶与动物源相比有一定的优势。微生物生长迅速、培养成本低，且能在短时间内产生大量酶本文考察了2种微生物胰蛋白酶的基本酶学特性及其对酪蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白等底物的作用性能及它们对脱灰裸皮的软化效果，并与2种典型的动物胰蛋白酶进行了比较，探究不同来源的胰蛋白酶的酶学性能差异与其软化效果之间存在的关联，为适合皮革软化用微生物来源胰蛋白酶制剂的开发和应用提供一定的指导。1 实验1.1 仪器和材料1.1.1 主要仪器及设备GSD型热泵循环不锈钢控温比色试验转鼓，无锡市新达轻工机械有限公司；UV-1100分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；扫描电子显微镜Phenom Pro，荷兰飞纳公司；TG16-W微量高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；pH/ISE测量仪，Thermo Orion Star A214 Benchtop，美国赛默飞世尔公司。1.1.2 主要材料微生物胰蛋白酶NB115和动物胰蛋白酶DY300由四川达威科技股份有限公司提供；微生物JD18由江南大学提供；动物胰蛋白酶PTN110由诺维信生物技术有限公司；黄牛盐湿皮，四川本地采购；脱灰二层皮粉和RBB染色弹性蛋白粉为实验室自制；其他试剂均为分析纯。1.2 实验方法1.2.1 酶活力测定酪蛋白活力：以酪素为底物，用福林法（GB/T23527-2009）测定胰蛋白酶的酪蛋白的活力胶原蛋白活力：按常规制革工艺制备的黄牛二层灰皮，经脱灰和充分水洗后，进行冷冻干燥、粉碎和过筛（20～40目）后得到脱灰二层皮粉底物。准确称量（300±0.1)mg皮粉加入50 m L离心管中，加入9 m L合适pH值的B-R缓冲液（0.1mol/L），在测定温度的恒温水浴中预热10 min，然后加入1 m L合适浓度的待测酶溶液，空白样加入1 m L缓冲液替代酶液，恒温反应30 min。反应结束后立即过滤，取2 m L滤液于消解管中，加入2 m L浓盐酸，在120℃下消解4 h。用优化的氯胺T法弹性蛋白活力：以Elastin-RBB为底物，按文献方法测定胰蛋白酶的弹性蛋白水解活力1.2.2 pH对酶活力的影响用上述的三种方法，在常用的软化温度（35℃）下，测定不同pH值（6～11）下，四种典型胰蛋白酶的酪蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白活力，得到酶的活力-pH曲线。1.2.3 温度对酶活力的影响在p H值8.5下，用上述的三种方法测定不同温度（25～45℃）下，四种典型胰蛋白酶的酪蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白活力，得到酶的活力-温度曲线。1.2.5 胰蛋白酶软化按常规制革工艺制备的浸灰黄牛皮，片皮后，取头层。沿灰皮背脊线两侧，相邻部位取样、分组，称重后放入不同转鼓中，脱灰后（脱灰结束pH约8.5），进行软化。分别在30℃和35℃下软化，用不同酶软化，酶制剂用量以各自相应温度下（30℃、35℃）的酪蛋白活力为依据，初始软化浴液中酪蛋白活力浓度20 U/mL。其他软化条件为pH8.5、液比0.5，转速12 r/min，软化时间6 h。软化浴液中羟脯氨酸含量分析：取软化5min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h后的浴液10 m L,3000 r/min下离心10 min，取2 m L上清液加入2m L浓盐酸，在120℃下消解4 h消解后，用氯胺T法软化皮粒面的弹性纤维染色分析：取酶处理后试样的邻近部位，用冷冻切片机将粒面层横切成20μm厚的薄片，用醛品红染色法染弹性纤维软化皮