致病菌毒力基因系统筛选方法.ppt

* Replicative transposition creates a copy of the transposon, which inserts at a recipient site. The donor site remains unchanged, so both donor and recipient have a copy of the transposon.这种类型的转座因子在反应中产生重复。因此转座的整个DNA序列是原转座因子的一个拷贝，而不是它本身。转座子作为移动的拷贝，即一个拷贝留在原处，另一拷贝插入到新的靶位点。 此类转座伴随着新拷贝的复制，转座涉及到两种酶：一是转座酶，作用在原来转座子的末端；二是解离酶，它作用在重复的拷贝上。 * IS、Tn 和 Mu 噬菌体都可能引起插入突变。插入位点若在一个顺反子（cistron)的前端功能基因中，可能造成极性突变（移码或终止密码突变）。 * 细菌生物膜（BF）,国内也有学者译为生物被膜，是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。 ? (一) 抗生素抗性：与浮游细菌相比，BF细菌对抗生素的抗性可提高10-1000倍。BF细菌抗药性主要取决于其多细胞结构：（1）BF中的EPS起屏障作用，限制抗生素分子向细菌细胞运输。多糖蛋白复合物还可与一些药物反应，具有中和药物的活性；（2）BF中微环境的不同可影响抗生素的活性，如局部酸性代谢产物的积累对许多抗生素的活性有拮抗作用。厌氧微环境可严重影响氨基糖苷类抗生素的活性等。此外，营养的消耗或抑制性代谢产物的积累可使一些细菌生长缓慢或停止分裂，这类细菌一般对抗生素敏感性差。在此，BF结构的不均质和BF细菌生理上的不均质性渗入的药物只能杀死一部分细菌，而另一部分细菌则存活下来；（3）表面生长可诱导细菌表达与浮游细菌不同的基因，诱导产生BF特异性表型。例如BF中的一部分细菌可进入一种类似牙孢菌的分化状态，其对抗生素有高度抗性；（4）多菌种BF中各菌种的协同作用。例如，产生β-内酰胺酶的菌种可保不产生此酶的菌种免受青霉素的作用。?? （二）对抗机体免疫防御：BF细菌可利用多种方式对抗机体免疫防御机制：（1）减少细胞因子（cytokine）的产生或酶解细胞因子。例如，表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）浮游细胞刺激人血淋巴细胞产生的γ干扰素量是BF细胞的8-16倍；（2）抵抗单核巨噬细胞的趋化作用；（4）BF细菌可刺激机体产生抗体，但这些抗体不仅难以灭杀BF内部的细菌，而且可在BF表面形成免疫复合物，损伤周围的机体组织；（5）BF诱导的补体转化和中性粒细胞呼吸明显下降。 * * 转座子，动态，突变示意，动物模型。Design of transposon tag，插入随机的标签片段 * Li,-Y-J; Danelishvili,-L; Wagner,-D; Petrofsky,-M; Bermudez,-L-ESO: J-Med-Microbiol. 2010 Jan; 59(Pt 1): 8-16 In vitro mutagenesis of Brucella species. Ficht TA et al. 2010.Methods Mol Biol;634:15-35. * differences in gene expression between in vitro and in vivo conditions * 启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。在基因表达的调控中，转录的起始是个关键。常常某个基因是否应当表达决定于在特定的启动子起始过程。那末，在某一特定启动子起始转录时是由什么来控制的呢? 不同启动子需要不同σ因子 　　DNA模板上专一地与RNA聚合酶结合并决定转录从何处起始的部位，也决定基因的转录效率。生物中有许多启动子，如大肠杆菌约有2000个启动子。 　　E．coli细胞中主要的σ因子可与核心酶一同被纯化，称为σ70，但菌细胞中另外有一些σ因子能够识别其顺序与 E.coli的主要启动子不同的另一些启动子，并促使核心酶起始转录。这些变异的σ因子在细胞中有特别功能，通常能剧烈改变细胞RNA的合成方式，以便在需要时使一组全新的基因得以表达。这是在枯草杆菌(Bacillus subtilis)中首次发现的，它们的作用是开启在芽胞形成(sporulation)过程中需要的一整套新的蛋白质的表达。噬菌体往往有其自己的σ因子，借以在噬菌体发育的某一特殊阶段开动其所需要的某些噬菌体基因的转录。 * 荧光素活化的细胞分拣术 荧光标定细胞分离技术 * 半乳糖苷酶 * MacConkey-0.4% ga