食用菌生物反应器研究进展.doc

食用菌生物反应器研究进展 　　生物反应器是指利用生物系统大规模生产有重要商业价值的外源蛋白，并将其应用于医疗保健和科学研究中。近年来，随着植物反应器研究领域的不断扩大，食用菌因其特有的性质也被应用到反应器中。随着高等生物分子生物学的发展和基因工程技术应用成功，许多科学家开始致力于食用菌遗传转化研究，在理论和应用上均取得了较大进展。?? 　　大量药理和临床实验已经证明多数食用菌不仅有食用价值，其药用价值也十分可观[1]。1991年世界首例双孢蘑菇（??Agaricus bisporus??）转化成功，标志着食用菌作为生物反应器的开始[2]。双孢蘑菇、平菇（??Pleurotus ostreatus??）、草菇（??Volvariella volvacea??）、杨树菇（??Agrocybe aegerita??）和香菇（??Lentinula edodes??）等食用菌遗传转化试验的成功为食用菌生物反应器的发展奠定了更加坚实的基础[3]。基于生物反应器领域的快速发展，本实验室开展了以食用菌作为生物反应器的研究，主要是通过菌丝体表达系统生产成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）等各种生长因子类药物，目前已经取得一定进展。笔者主要结合本实验室的相关工作对食用菌生物反应器的研究现状进行了综述。 　　1 概述 　　1982年首次成功地利用细菌作为反应器生产出了胰岛素[4]。1989年哺乳动物抗体在转基因植物中表达成功[5]。但因依赖微生物和动物生物反应器生产的外源蛋白成本高、安全性较差；植物生物反应器又具有潜在的破坏生态环境的危险性[6]，因此近年来许多科学家开始致力于食用菌基因工程的研究。食用菌生物反应器即利用食用菌作为新的基因工程的受体，生产人们所期望的外源蛋白，其主要特点是食用菌安全可食用且具有很强的外源蛋白分泌能力，基因组较小易于进行基因操作[7]。利用食用菌作为新的受体菌表达外源蛋白将更安全，产物更易于纯化，细菌作为生物反应器时，不能对真核生物的蛋白进行有效的翻译后加工，且本身可能是人类病原物。动物作为生物反应器时，在细胞培养过程中可能感染动物病毒而对人类健康造成潜在危害[8]，而利用食用菌作为反应器可以克服上述缺点。利用食用菌反应器易大规模生产来自动物、人类、细菌???病毒等的外源蛋白，成本低廉。微生物发酵常需要较大的设备投资，在发酵过程中常产生包涵体，而将其重新溶解并折叠成天然蛋白质需很高的成本[9]。 　　2 食用菌遗传转化系统的研究现状 　　2.1?σ糯?转化方法 　　用于转化丝状真菌的方法现已应用到大型真菌中，表1列举了5种被成功地应用于食用菌遗传转化系统的方法，表2列举了各种不同遗传转化方法之间的区别。 　　2.2?ζ舳?子 　　启动子是控制基因转录的上游元件，而转录调控是基因表达最为重要的一环，因此启动子是转化系统的重要成分。目前在食用菌转化领域对启动子的研究主要集中于强启动子和同源启动子。而同源启动子的使用则会有利于宿主细胞RNA聚合酶识别，提高转化效率[19]。CHEN等[19]在转化双孢蘑菇时，分别使用了双孢蘑菇的??gpd ??(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogen-ase)启动子、构巢曲霉的??gpd??启动子、花椰菜病毒的35s启动子，转化率分别为15%、1%和0%，这说明同源启动子有利于转化。?? 　　目前食用菌遗传转化使用的启动子主要有??ras??和??gpd??。食用菌的??ras??基因最早是从香菇中分离得到[24]，香菇的??ras??基因编码217个氨基酸，能激活腺苷酸环化酶，参与调节细胞循环中的cAMP水平，在香菇菌丝生长和子实体形成过程中有很高的转录水平。??ras??基因启动子含有1个CAAT盒、1个CACCC盒和2个连续的CACCC盒及CT丰富区[30]。用该启动子构建的载体已经用于糙皮侧耳（??Pleurotus ostreatus??） [31]、灰盖鬼伞（??Coprinus cinereus??）[32]、香菇 [23]、平菇 [33]的转化，获得了潮霉素抗性转化子，首例成功转化的香菇也是使用的该启动子。结果证明??ras??启动子具有较强的调控外源基因表达的作用。??gpd??基因是糖酵解途径的关键酶，它的调控序列(即??gpd??启动子)具有很强的调控异源基因表达的作用，最早从酵母中分离得到 [34]。??gpd??启动子富含CT序列，并具有CAAT和TATA盒[35]，已成功用于糙皮侧耳[36]、草菇[11]、灵芝[34]、银耳[14]、香菇[29]的外源基因的转化，并己被证明有很强的调控外源基因表达的作用。最近HIRANO等[37]从香菇中分离出了??gpd??基因