1.FCM简史2.分析和分选原理3.数据显示与分析.docVIP

流式细胞术在生物医学中的应用 河北省肿瘤研究所 左连富 前言 流式细胞术的简介   流式细胞仪的构造和工作原理 细胞的分选技术 狭缝扫描流式细胞仪 FCM检测数据的显示与分析 为表示所测信号的集中程度，变异系数被引入公式为 CV=?/? (?表示峰分布的标准误差，?是分布的均值)，CV值愈小说明分布愈集中。 实用上常用正态分布的半高峰宽FWHM来计算 CV值，FWHM指在峰高一半处量得的峰宽， 公式为 CV=FWHM / ? ×0.423 实际所测结果的CV值包括两部分，即仪器的CV值和样品的CV值。 样品的CV值是样品所固有的，与样品的物理性质，生物学特性，化学性质有关，亦即样品的本身、固定方法、染料性质、处理程序.染色的方法等，都能影响样品的CV值。 仪器的CV值可以通过仪器的准值校正来降低。具有较小CV值的仪器可能发现所测细胞的一些细节，当两个细胞群体的荧光量仅相差在5%时，如果CV值在5%，两个细胞群体就无法区分开来，当CV值小于3%以下时，两个细胞群体就可以分开。 流式细胞术可测量的细胞参数 主要测量参数分为结构和功能两部分 *结构参数 *功能参数 ?细胞大小与形态 ?氧化还原酶状态 ?胞核与浆比值 ?表面电荷和膜电位 ?色素颗粒 ?酶活性 ?亚细胞成分 ?PH值，?膜的流动性 ?DNA.RNA.蛋白质含量 ?线粒体膜电位 ?细胞表面 抗原 ?DNA的合成能力 ?硷性蛋白 ?细胞内和膜受体 ?染色体结构 ?细胞浆和膜的钙离子 ?细胞表面糖元等 ?细胞凋亡等 细胞分选可使被指定的细胞或细胞器、粒子等从一个细胞群体中被分选出来，FCM所测量的任何参数都可作为分选细胞的依据，分选出来的细胞的纯度常与作为分选依据的参数有关。分选包括如下步骤。 1.液滴的形成。 2.液滴的充电。 3.液滴的偏转。 4.分选参数电子窗口或门（GATA）的设置。 狭缝扫描流式细胞仪（Slit scanFlow Cytometry)与一般FCM基本结构相同，一般FCM的激光的光斑为撱圆形，光斑的直径大于被检测的细胞体积，所以称一般FCM为零分辨的流式系统。 在20世纪80年代，美国病理学专家Whleeless教授致力于FCM狭缝扫描技术的研制和发展，该项技术已经问世。它于一般现有的商品化FCM不同之处有以下几点。 ?一般FCM为零分辨率的检测技术，而狭缝扫描FCM是一种低分辨率的检测技术。 ?激光光束为一条线状扁平的光斑，直径在3--5?m，被检细胞的直径大于激光光斑直径，当细胞通过光束时，细胞各个部分被依次扫描，得出各部分的形态信号和定量分析。 ?狭缝FCM仪的光信号探测装置与一般FCM仪的设置不同，探测器分别在X.Y.Z三个方向设置。 狭缝FCM仪在定量分析和细胞形态研究具有极大的应用前景，尤其在体细胞遗传学的研究方面提供更为精良的分析技术。 目前，在世界范围内主要有两个厂家生产流式细胞仪，下面分别介绍各厂家的FCM仪器。 1. BECTION—DICKINSON公司，简称B-D公司，提供以下型号的仪器。 ⑴ FACScan,是一种不带分选功能的临床型的仪器，其性能稳定，配有15mW的长寿命氩离子激光器，用488nm波长的谱线可激发三色荧光，加上光散射参数共有五个测量参量。 ⑵ FACScount,是一种简单的流式细胞仪，专门用于T4和T8细胞表型计数检测，极适用于AIDS病的检测。 2.Beckman-Coulter公司，是多年来销售血球计数器的厂家，目前两种型号的流式细胞仪。 ? EPICS XL型，是COULTER公司生产的一种临床型的仪器，该仪器的特点是应用于488nm光束就可激发四色荧光的检测，这是该公司开发的一项专利技术，并主机与计算机由光纤联接，数据传送过程中丢失少，这也该机型的特点。 ?.ELITE ESP型，该型仪器是一大型的功能较强的FCM仪器，分选功能强大，分选速度最高可达15000个细胞/ 秒，可配置多种型号的激光器。在光学系统值得一提是在检测聚透镜的对面加有一反射镜，这将提高检测光的灵敏度。另一个特点该机型在荧光屏上可直接观察