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HPLC基础知识The Basic Knowledge of HPLC 色谱分析法简介 色谱法的分类 HPLC的特点及应用领域 HPLC的分类 HPLC相关的基本术语 HPLC的相关理论 HPLC的定性分析 HPLC的定量分析 HPLC仪器的组成 输液泵 检测器 色谱柱 进样器 工作站 P230的基本操作 HPLC方法的建立 液相色谱常见问题及其对策 液相色谱容易出问题的部件 仪器的维修和保养 色谱分析法简介 色谱法是一种重要的分离分析方法 ，它利用被分离的诸物质在互不相溶的两相中分配系数的微小差异进行分离。当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，使原来微小的差异累加产生了很大的效果，形成差速迁移，使各组分在柱内移动的同时逐渐分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的 “色谱”的来由 俄国植物学家 茨维特（Tswett） 1906年，他将从植物色素提取的石油醚提取液倒人一根装有碳酸钙的玻璃管顶端，然后用石油醚淋洗，结果使不同色素得到分离，在管内显示出不同的色带，色谱一词也由此得名 色谱法的分类 1.按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC） 根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC） 2.按分离机理分类 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法 利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法 HPLC的特点 HPLC应用领域 HPLC的分类 高效液相色谱法按照分离机制可以分为以下几类 液-固吸附色谱 固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸附 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性 液-液分配色谱 固定相与流动相均为液体（互不相溶） 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用。现今多采用化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。例如：C-18柱（反相柱） 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配 对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反 离子交换色谱 ion-exchange chromatography 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等 离子色谱 ion chromatography 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法 离子对色谱 原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配 排阻色谱色谱 size- exclusion chromatography 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布) 原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰 亲和色谱(AC) Affinity chromatograph 原理：利用生物大分子和固定相表面