肠道细胞释放操作流程.doc

解剖和分离肠道上皮细胞 试剂和仪器设备的准备: （1）无Ca2+/Mg2+的 PBS (CMF PBS)恢复至室温 （2）含终浓度5% FBS的无Ca2+/Mg2+的 Hank's Balanced Salt Solution 和 2mM EDTA，恢复至室温备用。 （3）37°C恒温振荡培养摇床。 注意:步骤1.1到1.7操作时动作要快,以减少细胞死亡的程度和达到最大细胞产量。 1.1 使老鼠在一个二氧化碳室安乐死，用70%乙醇喷雾对腹部和胸部表面进行消毒。 1.2 用剪刀在腹部中间剪开一个小的横向切口，并且把皮卷起来露出腹膜 1.3 剪断胃幽门括约肌使小肠上端与胃分离，用镊子去除肠系膜，再剪断回盲部，使完整的小肠与大肠分离。再将肛门边缘剪断，去除肠系膜，使大肠完全分离。 1.4 使用剪刀纵向切开结肠，室温下用CMF PBS洗掉肠腔内的粪便和粘液。 1.5 使用剪刀和镊子减掉小肠表面的PP节，然后纵向剪开小肠。 1.6 在室温下用CMF PBS清洗小肠内腔中的粪便和粘液。 1.7分别把大肠和小肠切成长约1.5厘米的小段，分别放入含有30ml预热的CMF HBSS/FBS 和 2mM EDTA的50ml离心管中。一个50ml离心管最多放一个肠道。 1.8将50ml离心管水平地放置于一个摇床上，于37°C ，250 rpm，孵育 20min。 1.9 将一个钢网筛置于一个废液桶上，分别将每个50ml离心管的内容物倒在滤网上，回收1.5厘米的肠子片断，再次置于含有30ml预热的CMF HBSS/FBS 和 2mM EDTA的50ml离心管中， 1.10 重复步骤1.8 2. 组织消化和肠道细胞的隔离 试剂和仪器设备的准备:（1）胶原酶溶液:1.5mg/ml的胶原酶VIII溶解在预热的含有40 μg/ml DNase I的 CMF HBSS/FBS 溶液中。 （2）预热的CMF HBSS/FBS和2mM EDTA （3）37°C预热的振荡培养摇床 （4）冰预冷的CMF HBSS/FBS 2.1第二轮震荡结束后，再次滤掉50ml离心管中的液体，将筛网上的1.5厘米的小肠片断转移至一个小的塑料盒中，用纸巾擦去多余的液体。 用剪刀直接在这个小盒内将1.5厘米的肠子尽可能剪碎，加入20ml的胶原酶溶液，并转移至50ml离心管，水平放置于振动器中消化，200 rpm， 10-20 min， 37 °C。 消化完毕后，短暂的漩涡振荡以确保彻底分离剩余的肠道组织，使用100μm的细胞过滤器过滤至置一新的50ml离心管中。 每管加入CMF HBSS/FBS终止消化，1500 rpm离心5min，4°C。如果离完心围发现沉淀，可将样品再次离心3.5min。重复此步骤一次 弃上清，用冰预冷的CMF HBSS/FBS重悬沉淀，置于冰上。 使用第三部分流式进行分析或第四部分进行磁珠富集或高速细胞分选。 3. 抗体标记染色，采用流式细胞仪分析DC和巨噬细胞 试剂和仪器设备的准备:（1）冰预冷的CMF PBS （2）冰预冷的染色缓冲液（(CMF PBS + 5% FBS)） （3）准备死细胞染色：使用LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ，用冰预冷的CMF PBS进行1:1000稀释， （4）在冰预冷的染色缓冲液中，配制下列荧光标记的单克隆抗体进行染色。 3.1将细胞转移至5ml的聚苯乙烯圆底(FACS)管。 3.2用冰预冷的CMF PBS将细胞洗两遍。 3.3将细胞与死细胞染液于黑暗处冰上孵育15min。 3.4用冰预冷的CMF PBS将细胞洗两遍。 3.5用2.4G2 anti-FcγRIII/II封闭细胞，冰上10min。 3.6用冰预冷的CMF PBS将细胞洗两遍。 3.7将细胞与预先配制的抗体染液于黑暗处冰上孵育20min。 3.8用冰预冷的染液缓冲液将细胞洗两遍，重悬于400μl冰预冷的染色缓冲液中，用40μm滤网过滤至新的FACS的管中。 3.9通过BD 公司的LSR II流式细胞仪进行分析。 4. 肠道DCs和巨噬细胞的富集 （1）冰预冷的染色缓冲液 (CMF PBS + 5% FBS) 4.1根据操作说明，使用抗体CD11b 和 CD11c MACS beads与步骤2.5获得单细胞悬液孵育。 4.2使用预冷的染色缓冲液???洗细胞并离心 弃上清，用1ml冰冷的染色缓冲重新悬浮细胞颗粒，先通过100μm细胞染色过滤器过滤，再使用40μm的进行过滤。 4.4使用MACS LS磁柱富集阳性磁珠细胞。 4.5重复4.2，弃上清 4.6与细胞表面标记孵育，如3.7中描述的步骤 4.7利用冰冷的染色缓冲液将磁珠富集的细胞洗两次，重悬于500μL不含叠氮钠的冰冷的染色缓冲液，通过40 μm滤网过滤至于F