ELISA检测原理.ppt

竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） 竞争法 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测 * ELISA检测原理 新疆医科大学附属肿瘤医院  酶免疫技术的特点 主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性 抗原抗体反应的特异性 + 酶高效催化反应的专一性 原理及特点 一、酶和酶作用底物 辣根过氧化物酶（HRP） 糖蛋白（主酶） 亚铁血红素（辅基） 主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心 RZ值：403nm （辅基）　　　与275nm（主酶） 　　　OD值之比 RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要 ELISA中应用最为广泛的标记用酶 常用酶 HRP的常见底物 邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB 5-氨基水杨酸5-ASA 2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS 常用底物 酶和酶作用底物 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。 　HRP的常见底物 酶和酶作用底物 酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物（conjugate） 酶标记物 通过化学反应或免 疫学反应，让酶与 抗体或抗原形成的 结合物 二、酶标记抗体或抗原 固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面 三、固相载体 将抗原或抗体结合于固相载体 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附 包被coating 封闭blocking 包被与封闭 　酶联免疫吸附试验 　 底物显色 定性或定量的分析 原理 包被 反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体 洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离 1 2 3 4 一、基本原理 双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等 ELISA检测抗原的方法 双抗体夹心法测抗原 + - E E E E E E E E E ELISA检测抗原的方法 双位点一步法该法是针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的决定簇的两种单克降抗体，即包被使用一种单抗，酶标记使用另一种单抗。测定时将含待测抗原标本和酶标抗体同时加人进行反应，两种抗体可不干扰，经过一次温育和洗涤后．即可加入底物进行显色测定。 ELISA检测抗原的方法 竞争法测抗原 + - E E E E E E E 2、加待检物 抗原与酶标抗 原竞争与抗体 结合 3、加酶作用 的底物不显色 或显色弱 3、加酶作用 的底物显色 1、已知抗体包 被于载体表面 1、已知抗体包 被于载体表面 2、加待测物 和酶标抗原， 酶标抗原与抗 体结合 E 间接法 方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定 ELISA检测抗体的方法 间接法测抗体 - E E E E E E E E E + 双抗原夹心法 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体 ELISA检测抗体的方法 ELISA检测抗体的方法 竞争法测HBcAb * * *