(1.4.4)--实验 氨基移换作用.ppt

本实验是将谷氨酸与丙酮酸，在肝匀浆中的谷丙转氨酶（GPT，ALT）作用下进行氨基移换反应，然后用纸上层析法检查反应体系中丙氨酸的生成，其反应过程如下：*实验八氨基移换作用［原理］ 体内α-氨基酸的α-氨基，在转氨酶的作用下，移换至α-酮酸的生成新氨基酸的过程，称氨基移换作用。此类酶有一定的特异性，普遍存在于动物各组织中。CH3C+COOHCH3CH-NH2COOHCOOHCH2CH+C=OCOOHCOOHCH2CH2CHCOOH丙酮酸Glu,Eα-酮戊二酸Ala,A转氨酶=O-NH2磷酸吡哆醛由于谷氨酸、丙酮酸在肝匀浆中，可循其它代谢途径分解和转化，影响氨基移换过程的观察，因此在的反应体系中添加一碘醋酸(或一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其它代谢过程。 *CH2ICOOH具有与带有-SH基的物质相结合的性质。因此以-SH为活性中心的酶，例如醇脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶等，可被碘乙酸特异地且不可逆地抑制。［操作］1.肝匀浆的制备称取肝脏约1.0克，经0.9%NaC1溶液洗去血污后，置研钵中研磨，然后加0.01MpH7.4磷酸缓冲液5ml磨成匀浆。2.转氨酶反应（1）取离心管2只编号，各加肝匀浆10滴，先将2号管置沸水浴中5分钟（为什么？）。（2）两管各加1%谷氨酸钾10滴，1%丙酮酸钠10滴，0.25%一碘醋酸钾5滴，同置40℃水浴中保温30分钟（3）取出向二管各加5%醋酸2滴，再同置沸水浴中5分钟，冷却后离心(2000rpm5分钟)，将上清液移入另外同样编号的试管中备用。3.层析验证（1）在10×20cm滤纸上，距短边1.5cm处用铅笔轻轻一画线(原线)，在原线上，每隔2cm处用铅笔作记，并在线下底边注明1、2、谷氨酸，丙氨酸记号。（2）分别用毛细管吸取1号液，2号液在层析滤纸上点样，注意斑点不可太大，一般直径约3mm为宜，约等5分钟干后（或烤干），在1、2号原点上，再重复点一次（注意，不可点错）。然后分别点上0.1%谷氨酸钾、0.1%丙氨酸，作为标准对照，干后置层析缸中展开1.5－2小时。12谷丙1.5cm*