(1.1.76)--25第二十五章++基因结构功能分析和疾病相关基因鉴定克隆.ppt

（一）基因定位的方法1．体细胞杂交法通过融合细胞的筛查定位基因2．染色体原位杂交是在细胞水平定位基因的常用方法3.染色体异常有时可提供疾病基因定位的替代方法4．连锁分析是定位疾病未知基因的常用方法（二）定位克隆的基本程序包括三大步骤1．尽可能缩小染色体上的候选区域2．构建目的区域的基因列表3.候选区域优先考虑基因的选择及突变检测（三）假肥大型肌营养不良基因的克隆是定位克隆的成功例证首先，根据患病女性X染色体与第21号常染色体的易位，以及男患儿发生小的Xp21.2缺失并伴发三种其他X连锁隐性遗传病，再运用RFLP连锁分析将DMD基因定位于Xp21。然后，分别克隆得到了基因的2个不同的片段，分别命名为XJ系列探针和pERT87系列探针，根据两片段的比较，证明DMD基因约为2300kb，占X染色体的1%以上，该基因编码肌营养不良蛋白（dystrophin），影响横纹肌和心肌的结构和收缩功能。假肥大型肌营养不良（DMD）三、确定常见病的基因需要全基因组关联分析和全外显子测序全基因组的关联研究（genome-wideassociationstudy,GWAS）全外显子测序（wholeexonsequencing）四、生物信息数据库贮藏丰富的疾病相关基因信息人们通过已获得的序列与数据库中核酸序列及蛋白质序列进行同源性比较，或对数据库中不同物种间的序列比较分析、拼接，预测新的全长基因等，进而通过实验证实，从组织细胞中克隆该基因，这就是所谓的电子克隆（insilicocloning）。结构基因编码区的确定、启动子、转录起始点确定和其他顺式元件的确定是了解基因表达的关键。分析编码序列的技术包括数据库搜索法、cDNA文库法、RNA剪接法等；研究启动子结构的技术包括生物信息学预测法、启动子克隆法、核酸-蛋白质相互作用分析法等；研究真核生物结构基因转录起点序列的技术包括数据库搜索法、cDNA克隆直接测序法、5′-cDNA末端快速扩增法、连续分析法等。其他顺式作用元件主要包括增强子、沉默子、绝缘子等，都可以参与基因表达调控。基因的功能由基因表达产物体现，也就是编码基因的蛋白质功能和非编码基因RNA的功能。基因产物的功能可以从三个不同水平来描述，即生物化学水平、细胞水平和整体水平的功能。鉴定基因功能的策略包括功能获得策略（如转基因、基因敲入技术）、功能失活策略（如基因敲除、基因沉默技术）、随机突变筛选策略及基因编辑技术等。疾病相关基因的鉴定和克隆，可采取非染色体定位的基因功能鉴定和定位克隆两类策略。（一）用功能获得策略鉴定基因功能基因功能获得策略的本质是将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因功能。转基因技术基因敲入技术1.用转基因技术获得基因功能转基因技术（transgenictechnology）是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞（embryonicstemcell），即ES细胞，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，随后将受精卵或ES细胞植入假孕受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。转基因动物（transgenicanimal）是指应用转基因技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和鉴定、转基因动物品系的繁育等。转基因小鼠最为常见。2.用基因敲入技术获得基因的功能基因敲入（geneknock-in）是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因，或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。通过基因敲入可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之前的基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。基因敲入是基因打靶（genetargeting）技术的一种。基因打靶是一种按预期方式准确改造生物遗传信息的实验手段。除基因敲入外，基因打靶还包括基因敲除、点突变、缺失突变、染色体大片段删除等。基因打靶与转基因技术均可用于基因功能研究，但二者的最大区别就是基因打靶能去除和/或替换生物体内的固有基因，而转基因技术则未去除或替换固有基因。目前，基因打靶已成为研究基因功能最直接和最有效的方法之一。（二）用功能失活策略鉴定基因功能基因功能失活策略的本质是将细胞或个体的某一基因功能部分或全部失活后，通过观察细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化来鉴定基因的功能。方法：基因敲除基因沉默基因敲除（geneknock-out）属于基因打靶技术的一种，其利用同源重组的原理，在E