(1.4.5)--生化实验 Kjeldahl氏定氮.ppt

*实验项目四蛋白质定量

Kjeldahl（凯氏）定氮法教学目的： 一、掌握凯氏定氮法原理，计算过程。

二、熟悉实验操作流程，酸式滴定管的使用方法。

三、了解NPN（非蛋白氮）的定义，正常值，凯氏定氮法的优缺点。

原理： 凯氏定氮法是测定有机物中氮含量的一种经典方法。

一、消化过程

含氮有机物+H2SO4CO2↑+H2O↑+SO3↑+NH3↑

2NH3+H2SO4（NH4）2SO4原理：二、蒸馏：

（NH4）2SO4+2NaOH——2NH3↑+Na2SO4+H2O

三、吸收：

NH3+H3BO3——NH4H2BO3

原理：四：滴定

NH4H2BO3+HCl——NH4Cl+H3BO3

0.1mol/L硼酸pH约为4.8左右，刚好是甲基红-溴甲酚绿（3：10）混合指示剂的变色中点。（pH5以上为绿色，pH5以下为红色，pH5时呈紫灰色，因此滴定终点非常敏锐和容易把握）

操作步骤

一、消化：取2支凯氏烧瓶，编号：

1号瓶：加0.1mL血清，0.2克K2SO4，12.5%CuSO40.3mL，浓H2SO41.2mL，玻璃珠一颗。 2号瓶：把血清换成蒸馏水，其它相同

消化时把K氏烧瓶斜夹在铁架台上（上加盖小漏斗），酒精灯加热，当溶液由透明——变成黑棕色（不透明）——蓝绿色（透明），消化完成。操作步骤

二、蒸馏

1、照图接好微量氨蒸馏器。

蒸汽发生器加水，甲基红和几滴硫酸（呈酸性，红色，防止水中的氨被蒸馏出），几块碎瓷片（防爆沸）。冷凝管下端置一烧杯接水。操作步骤

二、蒸馏

2、使蒸汽通过全部装置15分钟，然后取下蒸汽发生器，利用冷却产生的负压，将蒸馏管内的废液吸到外套管，开放下端管排出，然后保持此管为开放状态。操作步骤

二、蒸馏

3、在125mL锥形瓶内加0.1mol/L硼酸10mL和混合指示剂5滴（颜色呈紫灰色），置于冷凝管下端，使冷凝管的管口全部浸入硼酸溶液中。操作步骤

二、蒸馏

4、在蒸馏器的上方小漏斗加消化好的试样，用少量蒸馏水反复冲洗K氏烧瓶3次（每次约5mL蒸馏水左右）

5、在小漏斗上加40%NaOH7mL。轻轻旋转加样漏斗的活塞，使NaOH缓慢流入蒸馏管，留0.5-1mL左右封口，防止氨从此处逸出。操作步骤

二、蒸馏

6、夹紧蒸馏器下端的废液排出管，蒸馏，当看到冷凝管的下方硼酸溶液变为绿色时计时6分钟，然后将硼酸瓶下移继续蒸馏2分钟，最后用洗瓶冲洗冷凝管口。

7、取下蒸汽发生器，清洗蒸馏装置。操作步骤

三、滴定

用0.01mol/L标准HCl滴定锥形瓶中的溶液，使蓝绿色变为紫灰色（蓝绿色突然消失，红色还没出现），即到达滴定终点。*