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*实验项目十三
Km值测定教学目的: 一、掌握Km值的定义和意义,掌握可调式移液器的使用方法。
二、熟悉林-贝氏双倒数法测定Km及Vmax值的过程。
三、了解实验设计的思路,优缺点。
原理: 当温度、pH等条件恒定时,酶促反应速度V随底物浓度[S]增大而增大,二者关系符合米氏方程。
V= Vmax[S] Km+[S]原理: Km的值相当于酶促反应为最大速度一半时的底物浓度。是酶的特征性常数。用米氏方程作图求Km不方便,将方程双侧取倒数,即得到直线方程(林-贝氏作图法)。
1Km11
VVmax[S]Vmax=.+原理:1V1S1Km1Vmax原理: 酵母蔗糖酶Km的测定:
蔗糖酶分解蔗糖为葡萄糖和果糖,分解产物与碱性铜盐共热,在碱性条件下,Cu2+被还原为Cu2O,Cu2O再还原砷钼酸试剂生成钼蓝,钼蓝颜色的深浅与生成还原性糖的量成正比,通过比色分析,可求得酶促反应速度。原理: Cu2+————Cu2O
Mo+6————Mo+5----+2(蓝色)葡萄糖和果糖还原操作步骤
取13支试管,编号:0.20.20.20.2------------标准葡糖1号管30度保温10分钟后,加碱性铜盐终止反应,间隔准确1分钟终止1~6管--0.20.20.20.20.20.20.20.2酶混匀各管,30度保温5min后,1~6管间隔准确1分钟加保温的酶液1.01.01.01.01.01.01.0碱性铜盐0.81.00.10.20.30.40.50.10.20.30.40.50.6水--0.50.40.30.20.10.50.40.30.20.1-蔗糖--0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2缓冲溶液13121110987654321操作步骤
将13支试管同置沸水浴中加热20分钟后,冷却,每管加砷钼酸试剂1mL,摇匀后,放置5分钟,各加蒸馏水7mL,用塑料膜压住管口,颠倒混匀,660nm比色分析:
以1号管为酶空白测定2-11号管吸光度
以12号管为水空白测定13号管吸光度计算一、计算各管反应中所产生的还原糖的微量摩尔数。
二、按林-贝氏作图法以各管的实际蔗糖浓度的倒数作横坐标即1/[S],以各管每分钟产生的还原糖的微摩尔数的倒数为纵坐标即1/V,绘制直线
三、求出Km及Vmax结果(供参考)
2:0.122
3:0.244
4:0.335
5:0.475
6:0.658
7:0.008
8:0.016
9:0.024
10:0.089
11:0.189
13:0.250
2-7:0.114
3-8:0.228
4-9:0.311
5-10:0.386
6-11:0.469
结果(供参考)
2-7:0.114
3-8:0.228
4-9:0.311
5-10:0.386
6-11:0.469
13:0.250
2号管:[S]=0.01M
3号管:[S]=0.02M
4号管:[S]=0.03M
5号管:[S]=0.04M
6号管:[S]=0.05M
*
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