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CRISPRi,CRISPRaCRISPRscreeningandsgRNA
library
◼dCas9的特征简介
◼运用CRISPR技术调控基因在细胞中表达的基本实验过程
◼CRISPR技术介导的转录抑制（CRISPRi）
◼CRISPR技术介导的转录活化（CRISPRa）
◼CRISPRscreen
dCas9的特征简介
◼RuvC和HNH结构域是Cas9蛋白负责切割
DNA的结构域
◼D10A和H840A突变分别会导致RuvC和
HNH结构域失去活性从而形成无DNA切割活
性的Cas9蛋白，即dCas9（deadCas9）
运用CRISPR技术调控基因在细胞中表达的基本实验过程
CRISPR技术介导的转录抑制（CRISPRi）
BFP蓝色荧光蛋白
KRABKruppel-associatedbox一种转录抑制因子
在GFP基因的启动子和编码区的8个位点设计gRNA，检测dCas9-KRAB+gRNA对
GFP表达的抑制作用。最高达15倍的抑制效果。C为瞬时转染，D为稳定转染
CRISPR技术介导的转录活化（CRISPRa）
将dCas9与转录激活因子VP64或者p65AD融合。在由mCMV启动子启动的GFP基因上游添加4个
Gal4基因的上游转录激活序列，其中有3个可被sgGAL4-1所识别的序列。dCas9-VP64、dCas9-
p65AD与gRNA共转染后，荧光强度分别提高25倍和12倍
◼FusionofdCas9toeffectordomainswithdistinctregulatoryfunctions
enablesstableandefficienttranscriptionalrepressionoractivationin
humanandyeastcells,withthesiteofdeliverydeterminedsolelybya
coexpressedshortguide(sg)RNA.
◼CRISPRinterference(CRISPRi)-mediatedtranscriptionalrepressionis
highlyspecific
◼可以和Cas9融合的抑制因子：
◼https:///crispr/interfere/
◼可以和Cas9融合的激活因子：
◼https:///crispr/activate/
CRISPRscreening
◼Knockouteverygene,butknock
outonlyonegenepercell
◼Getcellswithadifferentgene
knockedoutineachcell.Some
cellswilldie,butotherswill
survive.
◼NGSisperformedontheentire
mixedcellstodeterminewhich
sequencesarepresentandwhich
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