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Cas9的选择与制备
1、Cas9的选择
1.1Cas9蛋白的结构特点简介
1.2Cas9同源异构体
1.3密码子优化与NLS
2、Cas9表达载体的构建
2.1Cas9的体外表达
2.2Cas9在脊椎动物细胞中的表达
Cas9蛋白的结构特点简介
产脓链球菌和内氏放线菌的Cas9蛋白的三维结构
JINEKM,JIANGF,TAYLORDW,etal.StructuresofCas9EndonucleasesRevealRNA-MediatedConformationalActivation[J].
Science,2014
RNA诱导的Cas9蛋白由静止变为激活状态示意图
JINEKM,JIANGF,TAYLORDW,etal.StructuresofCas9EndonucleasesRevealRNA-MediatedConformationalActivation[J].
Science,2014
SpCas9突变体
Kleinstiver,BenjaminP.,etal.“EngineeredCRISPR-Cas9nucleaseswithalteredPAMspecificities.”Nature
(2015).PubmedPMID:
其他来源的Cas9蛋白
xCas9
采用定向进化对SpCas9进行突变
xCas93.7具有广阔的PAM区：NG,NNG,GAT,CAA
打靶活性高于Cas9，脱靶风险低于Cas9
xCas93.7cleavesmultiplePAMsatahigherefficiencythan
SpCas9:
NGT(4.5-foldefficiency)
NGC(2.1-fold)
NGA(1.6-fold)
GAAandGAT(5.2-fold)
Hu,JohnnyH.,etal.“EvolvedCas9variantswithbroadPAMcompatibilityandhighDNAspecificity.”Nature(2018)doi:
10.1038/nature26155PubMedPMID:
密码子优化与NLS
NLS添加的位置
如何选择Cas9蛋白？
确定实验目的
KnockoutorKnockinorActivationor
Repression？
确定物种
bacteria,yeast,wormsormammals.
特异性要求
Cas9-nickase，dCas9-FokI，eSpCas9，or
SpCas9-HF1
大小要求
SpCas9:1368氨基酸；SaCas9：1053氨基酸；
Cas12a：1353氨基酸；Cas12b：1108氨基酸；
CasX：986氨基酸；CasΦ（Cas12j）：700-
800氨基酸
PAM要求
Cas95`NGG
突变型Cas95`NGAN/NGNC5`NGAG5`NGCG
其他菌种来源的Cas95`NGRRT5`NNNNGATT5`NNAGAAW
5`NAAAAC
Cpf15`TTN
Activation
dCas9-VP64
Repress
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