07-2 基因编辑案例.pdf

CRISPR基因编辑案例介绍

1.CRISPR常规工作流程

1.1确定要使用的CRISPR系统

目的Cas酶类型gRNA靶向位点

敲除，永久性破坏基因功能Cas9/Cas9n/Base5‘外显子或者蛋白的

editor关键功能结构域

敲入，定点插入或者替换特定序列Cas9/Cas9n/Base目的区域

editor

干扰，降低目的基因表达dCas-抑制子启动子元件

激活，增强目的基因表达dCas-激活子启动子元件

筛选，高通量筛选目的表型相关的Cas9所有基因

基因

1.2选择Cas9/gRNA递送系统

1.3目的基因序列分析

◆目的基因的位置（常染色体/异染色体、着丝粒、长臂、短臂）、拷贝数、

是否存在同源基因？

◆目的基因的结构（外显子、内含子、CDS区的起始和终止位点，是否存在

多启动子？多种转录本?）

◆是否存在CpG岛？SNPs？

◆选择靶向区域：knockout选Exon1或者Exon2，或者靠近5`端的组成型Exo；

CRISPRi/a应该选择转录起始位点200bp内的序列；如果使用成对的Cas9n，

则要注意两个gRNA的PAM区应该相距20-40bp

◆对目标细胞系或者动物模型中目的基因的打靶区域进行PCR扩增和测序，

以获得打靶区域的真实序列。

1.4gRNA设计

◆使用目标区域的真实序列进行gRNA设计。

◆根据预测的中靶效率、脱靶效率、位置等信息选择2-3条候选

gRNA进行活性检测

1.5供体DNA设计

◆当利用HDR修复机制时，需要提供同源重组模板

◆双链DNA质粒，单链DNA质粒

◆要考虑同源臂长度、DSB与插入位点的距离、PAM区进行突变

等等

1.6构建gRNA/Cas9表达载体

◆根据递送系统（质粒、慢病毒、腺相关病毒等系统）构建表达

载体

◆gRNA和Cas9蛋白的mRNA

◆gRNA/Cas9核糖核蛋白复合物RNP（安全，高效）

1.7gRNA活性检测

◆递送至目的细胞中，检测候选gRNA活性

◆NGS、PCR+错配内切酶、PCR+TA克隆测序

◆目的基因的表达下降（WB）

1.8脱靶检测

◆对预测的脱靶位点进行NGS测序

◆对预测的脱靶位点进行PCR+Sanger测序

1.9正式实验

◆递送至目的细胞中

◆挑选中靶细胞单克隆并扩增、冻存

◆检测单克隆细胞基因型、目的蛋白表达情况

◆脱靶检测

2.Knockout案例

敲除猪MSTN基因SciChinaLifeSci

IF=4.611Q1

在Exon3敲除，形成

了不具有正常功能的

突变蛋白

Fan,Z.,Liu,Z.,Xu,K.,Wu,T.,Ruan,J.,Zheng,X.,Bao,S.,Mu,Y.,Sonstegard,T.