碱性磷酸酶试验.ppt

实验内容酶的提取及比活性测定底物浓度对酶促反应速度的影响pH对酶促反应速度的影响温度对酶促反应速度的影响

加入有机溶剂计算公式设加入Xml95%乙醇※至终浓度30%30%（B液体积+X）=95%×XX=30%B液体积÷95%-30%=0.462B液体积※至终浓度60%60%（上清液体积+X）－30%上清液体积=95%XX=（60%-30%）上清液体积÷95%-60%=0.867上清液体积[注意事项]各步加入有机溶剂量要准确。否则会影响整个实验结果。操作要在低温下进行加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温和变性。加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应及时离心。离心析出的蛋白质沉淀应立即溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的丧失。(二)碱性磷酸酶的比活性测定[原理]比活性的定义单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。用以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功与否的评价指标之一。测定样品的比活性必须测定：每毫升样品中的酶活性单位数。每毫升样品中的蛋白质毫克数。磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性AKP4-氨基安替比林磷酸苯二钠酚醌衍生物（红色）铁氰化钾根据红色的深浅用比色法测定酚的含量。37℃保温15分钟产生1mg酚者为1个酶活性单位。[操作步骤]

1.AKP活性单位测定取试管5支，按下表操作：2.蛋白质含量测定

取试管5支，按下表操作3.结果处理与分析结果处理表*目录*目录实验三酶学实验酶的提取及比活性测定酶的本质是蛋白质，其提纯方法常用分离纯化蛋白质的方法原料要求：新鲜、酶含量丰富来源：体液（直接提取）、组织（先破碎）匀浆+低渗方法：盐析、有机溶剂、层析、电泳先粗后细、多法配合保护酶的活性pH酶的最适pH不一定是酶的最稳定pH温度一般低温，个别例外（如丙酮酸羟化酶0℃不稳定，26℃稳定），防止反复冻融。氧化防止必需基团中游离巯基的氧化（β-巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇）重金属离子（EDTA乙二胺四乙酸）蛋白酶污染细胞破碎时溶酶体释放大量酶类（低温、蛋白酶抑制剂）介质的极性和离子强度根据酶的性质选择介质（蔗糖、甘油可提高疏水环境；KCl、NaCl、NH4Cl等提供高离子强度介质）检测酶提取纯化的指标酶的纯度：用比活性代表（单位重量蛋白质样品中所含酶的活性单位）酶的回收效率※在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的回收率一、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)的分离纯化及比活性测定[目的]1．掌握AKP分离纯化的实验原理、方法及注意事项2．了解检测AKP活性测定的原理和方法。[原理]机械破碎法制备肝匀浆

匀浆液低浓度醋酸钠：低渗破膜

低浓度醋酸镁：保护和稳定AKP

有机溶剂沉淀法分离纯化AKP

加入不同有机溶剂，重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质

33％丙酮(30％乙醇)：AKP溶解

50％丙酮(60％乙醇)：AKP不溶解

(一)碱性磷酸酶的分离提纯

[操作步骤]25g肝组织剪碎+0.01M醋酸镁-醋酸钠溶液75ml，匀浆机中匀浆取肝匀浆4ml(A液）A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测活性A2：取0.1mlA液+4.9ml生理盐水，待测蛋白浓度+2ml正丁醇，混匀2min，室温置30min，离心（3000rpm)5min下清液（吸取）沉淀（弃）+等体积丙酮，离心（2000rpm)5min上清液（弃）沉淀+0.5M醋酸镁2ml溶解（B液）[操作步骤]B液+95%冷乙醇至30%，离心（2500rp