实验一-哺乳动物基因组DNA的提取及纯化.ppt

鲁东大学分子生物学与基因工程实验实验内容哺乳动物基因组DNA的提取与纯化PCR基因扩增琼脂糖凝胶电泳检测DNAPCR扩增产物的回收纯化DNA重组－酶切连接大肠杆菌感受态细胞的制备及外源基因向大肠杆菌的导入质粒DNA的提取DNA的酶切检测外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及分析参考书分子生物学及基因工程实验教程（第二版）刘箭主编科学出版社基因工程实验（第二版）陈雪岚等编科学出版社基因工程原理（第二版）吴乃虎编著科学出版社基因克隆和DNA分析魏群等译高等教育出版社分子克隆实验指南（第三版）黄培堂等译科学出版社实验一哺乳动物基因组DNA的提取及纯化实验一哺乳动物基因组DNA的提取及纯化一、实验目的掌握组织基因组DNA提取的原理、方法；二、实验原理DNA抽提思路：破碎组织细胞去除细胞内杂质纯化DNA蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质基因组DNA的特性：分子量较大、易断如何保证DNA分子的完整性匀浆或液氮研磨所提取的DNA片段的大小：100～150kb用途：Southern杂交、基因组DNA文库的构建二、实验原理真核生物DNA以染色体形式位于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA的完整。SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白质与DNA分离，EDTA则抑制细胞中DNase的活性；蛋白酶K可降解蛋白质成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白质酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。三、器材与试剂1.器材玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、恒温水浴锅、台式离心机、移液枪、枪头（灭菌）、紫外分光光度计2.试剂组织匀浆液(SDS,EDTA等）、蛋白质酶K、TE缓冲液（pH8.0）、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提液、氯仿：异戊醇（24:1）抽提液、3mol/L醋酸钠(pH5.2)、异丙醇或无水乙醇、70%（V/V）乙醇、灭菌水移液枪的使用样品准备设定体积装枪头吸液放液使用完毕将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，延长移液枪的使用寿命材料蛋白酶K上层溶液匀浆液抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤醇沉淀DNA溶液【实验流程】基因组DNA的提取：0.1g猪肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎?转入玻璃匀浆器中，加入1mL匀浆液，匀浆至无组织块（冰上操作）?将匀浆液转入1.5mL小指管，?加入蛋白酶K20uL（20mg/mL），颠倒混匀?650C恒温水浴锅中水浴30min?12000rpm，离心5min，取上清移入另一离心管?DNA纯化加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10min?40C，12000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清四、操作步骤鲁东大学