DNA的提取与电泳.ppt

血液DNA的提取与电泳1．取洁净EP管1只，加入200μL抗凝血。2．加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。3.加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮。简短离心以去除管壁内的水珠。4.加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec。此时可能会出现絮状沉淀。简短离心以去除管壁内的水珠。5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm（13400×g）离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前请检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。7．向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW（使用前请检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。8．向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液。9.将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。10.将吸附柱CB3于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。11.吸附柱CB3转入一个干净的EP管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到EP管中，保存在4℃冰箱。注意事项（一）1．最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。2．材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。3.DNA沉淀用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙醇，试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀；而需要2倍体积的无水乙醇。但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀，且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去。4.若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。注意事项（一）5．此试剂盒可用于提取哺乳动物全血，当提取量为100-400μL时，DNA得量为3-10μg。6．此试剂盒可直接用200μL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，不足200μL可加缓冲液GA补足。7.如需处理更大体积血液，如300μL-1mL，应按以下步骤操作：在样品中加入3倍体积红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5min,期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1min（或3000rpm离心5min），吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。注意事项（一）8.在260nm的读数用于计算样品中的DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/mL的双链DNA，40μg/mL的单链DNA或RNA。C（μg/mL）=OD260×509.可根据在260nm以及在280nm的读数间的比值（OD260/OD280）估计DNA的纯度。1.8左右为好，低于此值表明有蛋白质或酚污染，高于此值表明有RNA污染。10.紫外分光光度法可检测浓度为1-50μg/mL的DNA样品。操作步骤：1．根据所需浓度（0.5%）称取0.5g的琼脂糖，加人100mLTBE（0.5×）溶液。2．微波炉加热1min进行化胶。3.对电泳槽的缝隙进行封胶。4.当冷却至60℃左右时，加入溴化乙锭5μL，然后灌胶，胶的厚度约在5~7mm(倒胶时注意沿一角缓慢倒入，防止气泡产生)。5.将梳子插入凝胶，制作点样孔。6.待凝胶凝固后（30-45min），将梳子垂直拔出。操作步骤：7．将凝胶板放入电泳槽，倒入电泳缓冲液，以超过凝胶1mm左右为准。8．在10μLDNA样品中加人1/5的上样缓冲液并混匀。9.用微量移液枪将DNA样品小心加入样品槽中。10.合上电泳槽盖，接通电源。控制电压保持在100V。11.当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约1cm时,停止电泳。12.放入紫外光透射仪观察并拍照。注意事项（二）1．可以在凝胶和电泳缓冲液中加入溴化乙锭，浓度为0.5μg/mL。2．溴化乙锭有潜在的致癌性，操作时要带上手套。3.在1-5V/cm凝胶的电压降下进行电泳。（按两极间距离计算）4.少至1-10ng的DNA条带即可在紫外灯下检出。5.如加入过多的DNA，加样孔超载，会导致拖尾和弥散。哺乳动物DNA限制酶消化产物，每孔可加入20-30μgDNA而不致明显影响分辨力。注意事项（二）6.一些限制酶（如BamHⅠ或EcoRⅠ）缓冲液中的高浓度盐会拖慢DNA的迁移率并使邻孔内DNA的电泳出现畸变。7.溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的泳动速度约为二甲苯