实验 细菌的革兰氏染色.doc

实验八、细菌革兰氏染色实验 一、实验目的和内容 目的：1.熟悉油镜的使用与保养。 2.掌握细菌革兰氏染色法的原理及实验操作。 3.了解革兰氏染色实验在细菌分类鉴定上的重要性。 内容：1.学习显微镜（油镜）的使用和保养。 2.学习细菌革兰氏染色实验。 3.用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片并判断其结果。 二、实验原理 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。染色前必须先固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。 三、实验材料和用具 （1）菌种：培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的青枯假单胞杆菌。 （2）染色液和试剂：吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液、结晶紫、鲁哥尔碘液、95 %酒精、复染剂（蕃红）、二甲苯、香柏油。 （3）器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、打火机、记号笔、擦镜纸、显微镜。 四、实验步骤： ①涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，做成菌液。 干燥（可过火3—4次）制成薄的涂面，注意取菌不要太多，过火速度要快。 ② 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1 min，倾去染液，流水冲洗至无色。 ③ 媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1 min，后水洗。 ④ 脱色：除去残水后，滴加95 %酒精进行脱色约15－20 sec，后立即用流水冲洗。 ⑤ 复染：滴加复染剂——番红染色液，染3－5 min，水洗后用吸水纸吸干。 ⑥ 镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察染色结果并绘图。 五、实验小结 （1）简述革兰氏染色实验的一般步骤。 （2）哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ （3）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？ （4）将实验结果填入下表并绘所观察到的细菌简图 实验结果： 菌株 革兰氏反应（阴/阳） 显色 菌体形状 菌体简图 1号菌 2号菌 DH菌 ★注意事项 1、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定，需要多加练习； 2、选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。