RNA反转录与DNA扩增实验.doc

PAGE PAGE 2 实验二 RNA反转录与DNA扩增实验 一、实验目的 1、了解并掌握RNA反转录的原理和一般步骤。 2、复习DNA扩增的原理及操作步骤。 二、实验原理 反转录PCR（Reverse Reaction，RT-PCR）又称为 逆转录PCR。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或 随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。 再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得 目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析 基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 RT- PCR即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的 聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。 三、实验材料 移液枪，枪头，超净工作台，离心机，PCR仪，离心小管，紫外分析仪， HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒，dNTP Mix，Primer Mix，RNA Template，5X RT buffer ，DTT, Water，2X Tap Master Mix， Primer(1,2), RNase-Free water等 四、实验步骤 （一）逆转录操作步骤 1.将RNA模板，引物，dNTP Mix，DTT，RT buffer, HiFi-MMLV和HiFi-MMLV溶解并置于冰上备用。 2.根据以下数据配置反应体系，总体积为19微升。 试剂 体积（微升） dNTP Mix 4 Primer Mix 2 RNA Template 3 5xRT buffer 4 DTT 0.1M 2 HiFi-MMLV 1 Water 3 总体积 19 3.涡旋震荡均匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 4.42℃孵育40min，85℃孵育5min。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。 （二）以cDNA为模板进行PCR扩增 1. PCR反应体系按下表加入 试剂 体积（微升） 2x Tap Master Mix 12 Primer(1,2) 2 TemplateDNA 1 RNase-Free water 10 总体积 25 2. 涡旋震荡均匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 3.将PCR仪设置好温度进行扩增，设置温度如下： 94℃ 2min→94℃ 30s→55℃ 30s →72℃ 30s→72℃ 2min 30个循环 4.待反应结束后，进行电泳17min，取出胶片放在紫外分析仪下进行观察。 五、实验结果 六、实验分析 从左边数第六个和第八个是我组的可以看出有明显的条带，实验比较成功，说明RNA转录并扩增成功。由于制的胶较厚，电泳了快20min。