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om基因家族基因克隆及原核表达质粒的构建 桉树是世界上最重要的纸浆和造纸材料。它已有100多年的历史。它是中国南方和亚热带最重要的快速人工造林树种，在中国造纸行业中发挥着非常重要的作用。近年来,桉树木材又被开发成生物柴油,使得桉树有成为新型生物质能源树种的巨大潜力。木质素是一种具有三维立体结构的天然高分子聚合物,广泛存在于高等植物的维管束中,是木质部细胞壁的主要成分之一。在木材细胞壁中,木质素作为一种填充和粘合物质,以物理或化学的方式与纤维素和半纤维素相互之间紧密粘合在一起,而在制浆造纸工业中,需要将木质素从纤维素和半纤维素中去除,从而产生大量的造纸废液,严重污染环境。因此,去除木质素已成为制浆造纸工业污染的主要源头物质。木质素含量降低除了能够减少造纸工业药品和能量的消耗,也能明显提高纸张的白度和颜色稳定性。不同类型植物的木质素单体组成明显不同,裸子植物主要为愈创木基木质素(G木质素),双子叶植物主要含愈创木基-紫丁香基木质素(G-S木质素),单子叶植物则为愈创木基-紫丁香基-对-羟基苯基木质素(G-S-H木质素)。木质素三种单体的比例对造纸过程中木质素去除难易程度和饲料中可消化性都具有重要影响。 氧位-甲基转移酶基因家族(O-Methyltransferase,OMT)通常作用于植物体内木质素生物合成、类黄酮生物合成、生物碱生物合成等次生代谢途径中一些小分子的甲基化,而这种甲基化则决定了这些小分子在植物体内生理功能的特异性。COMT(咖啡酰O-甲基转移酶)和CCo AOMT(咖啡酯乙酰辅酶A氧位-甲基转移酶)是OMT基因家族中控制植物次生细胞壁中的木质素含量和组分的关键基因,对木材结构和强度等特性有密切关系,能够控制木质素G、S、H三种单体的比例和含量,是决定木质素单体组分比例和木质素去除难易程度的关键基因。通过在大肠杆菌等原核生物中表达目标基因的核苷酸序列片段,翻译合成异源目的蛋白,可以方便快捷地研究目标蛋白的功能特征和酶学特性。本研究通过融合(硫氧化还原蛋白A,trx A)原核表达方式,对赤桉COMT、CCo AOMT1、CCo AOMT2三个基因进行高效表达与纯化,为进一步研究这三个蛋白的功能和酶学活性提供基础。 1 材料和方法 1.1 pcr扩增对基因cds扩增 根据已克隆的赤桉COMT基因(GU109375)、CCo AOMT1基因(GQ889423)、CCo AOMT2基因(GQ889422),设计带有酶切位点的PCR扩增引物,扩增目的基因的CDS(coding sequence)序列。在COMT基因扩增正向引物和反向引物分别引入Eco RI和HindⅢ酶切位点,CCo AOMT1和CCo AOMT2基因扩增正、反引物则分别引入Eco RI和Xho I酶切位点,用于插入至p ET-32a原核表达载体中(表1,其中下划线表示酶切位点)。 1.2 ob定位酶的pcr检测 用含有目的基因全长c DNA片段的三个质粒DNA为模板,进行目的基因CDS序列的PCR扩增。使用PCR引物(表1)和Takara Pyrobest酶进行扩增,PCR程序为:预变性(94℃/5 min);变性(94℃/40 s)、退火(45 s)、延伸(72℃/120 s),35个温度循环;总延伸(72℃/8 min)。COMT、CCo AOMT1、CCo AOMT2的退火温度分别为60℃、62℃、58℃。纯化回收目的产物,双酶切后,与经相同双酶切的载体p ET-32a进行体外连接,连接产物转化至大肠杆菌DH5α,构建出最终的原核表达质粒。 1.3 itpg诱导培养法 将三个表达质粒分别转化至大肠杆菌表达菌株BL21(λDE3),接入5 m L含Amp抗生素的LB培养基中,37℃震荡培养至OD600值达到0.4,再按1∶100比例稀释接种至新鲜的50 m L LB培养基,37℃震荡培养至OD600达0.6,加入100mmol的IPTG贮藏液至终浓度为0.4 mmol,进行诱导培养。在加入ITPG后的2 h、3 h和4 h,分别取5 m L菌液离心收集菌体。用500μL的PBS缓冲液重悬菌体进行超声波破碎,离心分离出的上清液即为菌体的可溶性蛋白质。 1.4 菌株的制备和纯化 (1)原核表达体系的放大培养。按照已优化的原核表达体系,放大成500 m L的培养体系,用于提取并纯化目的蛋白。为获得良好的通气,培养基体积不超过摇瓶容量的20%。 (2)渗透休克法提纯目的蛋白。将摇瓶置于冰上5分钟,于5 000 g条件下4℃离心5 min收集菌体。再用适量预冷(约100 m L)的高渗透压溶液(80%蔗糖,2.5 mmol EDTA,20 mmol TrisHCl(p H 8.0))重悬菌体,使菌体浓度达到OD550值等于5单位/m L,冰浴静置10 min;于