实时荧光定量PCR技术PPT课件(模板).ppt

实时荧光定量PCR技术 ;常规PCR与实时荧光定量PCR;荧光定量PCR常用的三个概念;Cycle（循环数）;Cycle（循环数）;Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数;Ct值的数学原理;数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。 Bioer－Linegene series 荧光定量PCR-- NTC 实时荧光定量PCR的分类——分子信标 结果与双标准曲线法相近 大多数荧光定量PCR实验的CT值在18-30之间。 荧光定量PCR参数解析-- CT值 realmastermix -引物和扩增产物二级结构的预测 乙肝病人血液中HBV的绝对定量 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准 样品扩增：正常vs肿瘤 设计合适引物，防止非特异性扩增！ 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； 方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 ERBB2 copies / GAPDH copies 对引物特异性要求较高 ??Ct Method: 使用内参基因定量所研究样品和参照样品目的基因， -扩增长度50 - 150 bp (max 400);qPCR 常用实验方法;;热 变 性;问题点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。 ;将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT);融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光 定量准确; 使用方便，不必设计复杂 探针 具有价格优势;Taqman探针法——原理;Taqman探针法——工作机理;1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃ 2、反应参数的确定： 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM 4、其他与常规PCR相同;Bioer－Linegene series 退火温度优化：梯度PCR Healthy RNA 模板浓度高，只需较少的扩增循环就可累积足够的产物，产生高过背景的荧光信号，那么CT值就会很早出现，相反CT值则会较晚出现。 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) Export Department Export Management Export Department Export Management E -G+C content 30 - 80% 维基百科/google ??Ct Method: 使用内参基因定量所研究样品和参照样品目的基因， 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数 荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 ABI-7series cDNA影响qPCR敏感度 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 将Ct值带入线性方程： 融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。 18-30 cycles 大多数荧光定量PCR实验的CT值在18-30之间。 相对定量：2－△△Ct法; 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成;;高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低; 几种方法的应用比较;绝对定量 标准曲线由已知浓度的RNA、质粒生成 定量未知模板 标准样品和未知样品必须同时反应 相对定量 ??Ct Method: 使用内参基因定量所研究样品和参照样品目的基因， 参照基因可以与目的基因同时反应，也可以单独反应。 双标准曲线法：对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。 ;Sample;一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组D