DB37T 3128.1-2018I群禽腺病毒感染诊断技术 第1部分：病毒分离鉴定.docx

ICS 65.020.30 B41 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3128.1—2018 I 群禽腺病毒感染诊断技术 第 1 部分：病 毒分离鉴定 Diagnostic techniques for Fowl Adenovirus Group I infection Part 1：Isolation and identification ofFAdV group I 2018 - 02 - 02 发布 2018 - 03 - 02 实施 山东省质量技术监督局 发 布 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东农业大学。 本标准主要起草人： 刁有祥、陈浩、唐熠、窦砚国、郑肖强。 I 群禽腺病毒感染诊断技术 第 1 部分：病毒分离鉴定 1 范围 本标准规定了I群禽腺病毒样品的采集与保存、病毒的分离和鉴定等的技术要求。 本标准中I群禽腺病毒分离与鉴定技术适用于I群禽腺病毒中12种血清型病毒的分离鉴定、间接免疫 荧光试验（IFA）适用于上述病毒的检测、限制性片段长度多态性分析（RFLP）适用于对I群禽腺病毒12 种血清型病毒的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范动物检疫 3 术语和定义 下列定义和术语适用于本文件。 3.1 I群禽腺病毒 Fowl adenovirus group I 是引起家禽包涵体肝炎和肝炎-心包积液综合征的病原，基于交叉中和试验结果，该病毒可分为12 种血清型。 3.2 间接免疫荧光试验 Indirect immunofluorescence assay （IFA） 用对应某一种抗原的抗体(这里被称为一抗)与细胞孵育结合，在采用对应一抗(也就是抗一抗)的抗 体(这里被称为二抗， 二抗上偶联有荧光素分子)与细胞孵育结合后在荧光显微镜下观察， 出现绿色荧光 信号为阳性反应。 3.3 限制性片段长度多态性分析 Restriction Fragment Length Polymorphism（RFLP） 利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子， 即产生限制性片段的 特性， 用于检测DNA序列多态性。 3.4 LMH细胞 a) 生物安全柜； b) PCR 仪； c) CO2 恒温培养箱（37℃恒温） ； d) 台式低温高速离心机（最大转速 12000r/min）； e) 电泳仪； f) 电泳槽； g) 紫外凝胶成像仪； h) 2 °C～8 °C 冰箱； i) - 20 °C 冰柜； j) 微量移液器（最大量程分别为 10μL、20μL、100μL、1000 μL），带滤芯的枪头； k) 孵化器（37℃恒温）； l) 水平摇床； m) 电子天平精度为：0.001g； n) 电磁炉或微波炉； o) 荧光倒置显微镜（FITC）。 4.4 试剂和材料 除另有规定外， 所有生化试剂均为分析纯。 a) 磷酸盐缓冲液（pH=7.0～7.4），见 A.1； b) 细胞培养液（含 10%血清的 DMEM 培养基） ； c) 细胞维持液（含 1%血清的 DMEM 培养基）； d) 甲醇： 丙酮（1:1）固定液； e) 抗体稀释液 PBST，见 A.2； f) 商品化的 FITC 标记鼠抗兔荧光抗体； g) 兔抗 I 群禽腺病毒多克隆抗体（灭活疫苗免疫兔制备）； h) 50 %甘油； i) 商品化的 DNA 提取试剂盒； j) rTaq DNA 聚合酶(5 U/ μL)； k) 10×PCR Buffer； l) dNTPs（2.5 mmol/L）； m) 商品化的 DNA 分子量标准， 要求在 100 bp～2000 bp 之间，有 5 条以上的指示条带； n) 1.5 %琼脂糖凝胶，见 B.1； o) 1×TAE 缓冲液， 见 B.2； p) 溴化乙锭（10μg/ μL），见 B.3； q) 核酸电泳加样缓冲液，见 B.4； r) 商品化核酸凝胶纯化试剂盒； s) DNA 限制性内切酶 Hae II； t) 阳性对照标准品， I 群禽腺病毒细胞培养物； u) 阴性对照标准品，高压灭菌的蒸馏水； v) 本标准中使用的水均按照 G