NY_T 4035-2021CN鸡滑液囊支原体感染诊断技术.pdf

ICS 11.220CCS B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T滑液囊支原体感染诊断技术Diagnostic techniques for Mycoplasma synoviae infection2021-12-15发布2022-06-01实施公中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 4035—2021目次前言范围2规范性引用文件3术语和定义临床诊断5实验室诊断综合判定附录A(资料性)鸡滑液囊支原体分离鉴定溶液的配制附录B(资料性)鸡滑液囊支原体的分离鉴定附录C(资料性)gPCR的特异性扩增序列(119bp)附录D(资料性)实时荧光定量PCR阳性质粒的制备及标准曲线的建立附录E(资料性)鸡滑液囊支原体MSBP蛋白抗原的制各附录F(资料性)鸡滑液囊支原体阳性对照血清的制备附录G(资料性)鸡滑液囊支原体阴性对照血清的制备附录H(资料性)间接ELISA实验溶液的配制 NY/T 4035—2021附录A(资料性)鸡滑液囊支原体分离鉴定落液的配制A. 1酵母漫出液称取醇母粉200g，加人800mL~1200mL去离子水，在28℃~32℃下磁力搅择1h~1.5h，使细份充分分散、混匀、发薛；然后逐新增加温度到40C，此过程需要10min～15min；之后每分钟增加5C，不断搅拌，防止酵母烧糊致使营养成分破坏；加热至沸点维持5min，总时间控制在2h左右，减少污染杂菌的概率；冷却至室温，3500t/min离心20min，取上清液，先用滤纸过滤，然后依次用0.8μm、0.45μm，0.22m的滤器过滤，将滤液按每份50mL分装后冻存于一20C备用，半年内使用。42SP4液体培养基PPLO肉汤3. 50 g10%酯酸轮溶液5 mL胰蛋白陈10. 00 g蛋白陈5. 00 g葡萄糖5. 00 g加150mL蒸增水溶解，用NaOH调pH至7.6±0.2，121℃、15min高压灭菌。取出后室温冷却至45C~50℃，无菌条件下每1000mL培养液加CMRL-1066500mL，酵母浸出液30mL，1%的酚红呤二核苷酸0.1g/L，轻轻摇勾，置4保存，一个月内使用。A. 3SP4固体平板PPLO 肉汤3. 50 g10%醋酸轮溶液5 mL映蛋白陈10. 00 g蛋白陈5. 00 g葡萄糖5. 00 g琼脂粉4. 00 g加680mL蒸馏水溶解，用NaOH调pH至7.6士0.2121℃、15min高压灭菌。取出后室温冷却至45C50℃，无菌条件下每1000mL培养液加胎牛血清150mL，青霉素80万单位/L~100万单位/L，L-率胱氨酸盐酸盐0.1g/L，烟酰胺腺票呤二核背酸0.1g/L，轻轻掘匀，立即倾例于直径90mm的一次周内使用。A. 4HI bufferNaCI8. 50 gKH,PO,0. 162 5 gNa, HPO,0. 54 g加人去离子水800mL,待固体试剂全部溶解后，定容至1000mL.用HCI或NaOH调节pH至7.2，121C、15min高压灭菌，4C保存，7 NY/T 4035—2021附录B（资料性）鸡滑液囊支原体的分离鉴定B.1鸡滑液囊支原体特征性落(10×)见图 B. 1,图B.1鸡滑液囊支原体特征性菌落(10×)B.2鸡滑液囊支原体吉姆萨染色(100×)见图 B.2。图B.2鸡滑液囊支原体吉姆萨染色(100×） NY/T录C(资料性)qPCR的特异性扩增序列(119bp)CTAAATACAATAGCCCAAGGCAAAAAAAGCGATACACAACCGCTTTTAGAAAAATCTAAAAGCTTTCAGTTAATAAAAAATGCCTTTTGTAAAAATAATGTACTCCGTAAGAAAGGAGG6 NY/T 4035—2021附录D(资料性)实时荧光定量PCR阳性质粒的制备及标准曲线的建立D.1仪器恒温掘摇床、制冰机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仅、实时荧光定量PCR仪。D.2试剂引物MSZL-F/MSZL-R(25pmol/μL)，等效商晶化胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒、pMD-19T质粒、感受态大肠杆菌JM109、10mg/mL氨卡青毒素和LB培养基D.3引物序列上游引物 MS ZL-F:5'-TGCCCGAAGTCGGTTTGTTA-3’;下游引物 MS ZL-R;5'-TCAACGAGGCTTATCGCAGG-3′D.4阳性质粒的构建和鉴定D.4.1扩增、回收PCR产物性5min，35个循环（95C变性45s，60℃退火1min，72C延伸1min)；72C再延伸10min，4C保温5min。取5μLPCR产物于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，以确定扩增得到大小为506bp的目的基因片段。D. 4. 22质粒构建及鉴定用商品化胶回收试剂盒回收纯