MicroRNA的研究及应用课件.pptxVIP

1MicroRNA的研究及应用 2概述miRNA是由21~25个核苷酸组成的非编码RNA；它通过与靶基因的3-UTR的配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达；它在生物体生长发育、细胞增值、分化、凋亡以及人类各种疾病等的发生发展过程中发挥重要的调控作用。?什么是miRNA？ 3概述 · MicroRNA的发现lin-4: Lee等人于1993年在线虫中通过胚胎发育时间控制缺陷性遗传筛选实验中发现，是第一个被发现的miRNA。 lin-4在L1,L2阶段大量表达，如缺失，则导致幼虫发育停顿。 L1 L2 L3 L4L1~L4，线虫发育的四个不同阶段 4let-7: Rinhart等人于2000年在线虫发现第二个miRNA， let-7。 let-7在L3,L4阶段大量表达，控制幼虫的L4阶段向成虫阶段发育转换。L1~L4，线虫发育的四个不同阶段 L1 L2 L3 L4概述 · MicroRNA的发现 5MicroRNA的起源与生物合成过程1. miRNA基因被转录成pri-miRNA (RNA 聚合酶Ⅱ)；2. pri-miRNA被剪切成具有70-100个核苷 酸 的pre-miRNA (Drosha,DGCR8)； 3. pre-miRNA从核内被转移至胞 (Exportin-5, Ran-GTP)；4. pre-miRNA被剪切成21-25个核苷酸的双链 RNA双体 (Dicer,TRBP,PACT)；5. 双链RNA双体中成熟miRNA链会选择性整合入RISC,并与mRNA互补配对。 6MicroRNA的起源与生物合成过程microRNA genePol Ⅱ ① ② Drosha/DGCR8Pri-miRNAPre-miRNACytoplasm③ ④ Dicer/TRBP/PACTduplex intermediate⑤ RISCmature miRNAmiRNA biogenesis NucleusExportin-5/Ran-GTP 7miRNA与siRNA的性质比较 miRNA siRNA相同点长度及特征分子量约22nt，5'端是磷酸基，3'端是羟基合成的底物均由双链RNA或RNA前体加工而来Dicer酶依赖Dicer酶并具有Dicer加工产物的特征Argonaute家族蛋白均需Argonaute家族蛋白参与RISC均为RISC组分，在介导沉默机制上有相似之处作用方式均可抑制靶基因翻译或导致mRNA降解进化关系两种假设：siRNA是miRNA的补充；miRNA在进化过程中替代了siRNA 引自 方福德, microRNA的研究方法与应用, 中国协和医科大学出版社, 2008 8 miRNA siRNA不同点机制性质是生物体正常的调控机制往往是外源引起直接来源发夹状pre-miRNA长链dsRNA分子结构单链RNA双链RNA， 3‘端有2个非配对碱基对靶基因mRNA特异性较低，一个突变不影响miRNA的抑制作用较高，一个突变容易引起RNAi沉默效应的改变作用方式miRNA途径RNAi互补性不完全互补，存在错配现象一般要求完全互补生物学功能对机体的生长发育有重要作用抗病毒的防御机制；沉默过表达的mRNA；保护基因组免受转座子侵入重要特性高度的保守性、时序性和组织特异性高度特异性续表1 9 miRNA siRNA不同点作用机制通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶基因mRNA，并与之部分互补，从而抑制其翻译。在动物中，成熟的miRNA与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合mRNA 3‘-UTR，从而抑制其翻译。miRNA也可切割完全互补的mRNA渗入RISC中，引导复合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开siRNA，通过反义siRNA链识别目的mRNA，通过内切酶活性切割目的片段，再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。siRNA也可以抑制具有短片段互补性的mRNA翻译 加工过程不对称加工，仅剪切pre-miRNA一个侧臂，其他部分降解对称地剪切来源于双链RNA前体的两个侧臂对RNA的影响与mRNA的稳定性无关影响mRNA的稳定性作用位置作用于靶基因3‘-UTR作用于mRNA的任何部位生物学意义主要在发育过程中发挥作用，调节内源性基因的表达不参与生物发育，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性与抵御病毒感染续表2 10MicroRNA的鉴定 正向遗传学的突变筛查方法（最初几个miRNA分子的发现；效率不高）；cDNA克隆技术（有优