不同肉质颜色萝卜DFR基因表达差异分析.docx

? ? 不同肉质颜色萝卜DFR基因表达差异分析 ? ? 陈发波 高健 姚启伦 Summary：为了探明DFR基因的表达量与萝卜红色素含量之间的关系，以16个色素含量不同的萝卜品种为研究材料，测定肉质根色素含量和DFR基因的表达量，并进行方差分析。结果表明，不同类型萝卜品种间色素含量存在真实的差异，16个萝卜品种间色素含量变幅在0.01‰～25.43‰，平均值为7.40‰。采用RT-PCR法定量分析DFR基因相对表达量，结果表明，DFR基因在16个品种萝卜中的表达差异达到了极显著水平，DFR基因表达量在0.077 9～6.639 3 之间，平均值为1.574 1。对16个萝卜品种的DFR基因表达量与色素含量进行相关分析，结果表明，DFR基因相对表达量与色素含量之间的相关系数为0.89，达到了极显著水平，说明DFR基因的表达量越高，萝卜红色素的含量越高。推测DFR基因可能是萝卜红色素合成的关键基因，可将其作为萝卜或其他作物色素生产基因工程的候选基因。 Key：红心萝卜;红色素;RT-PCR;DFR基因;表达量;方差分析 ： S631.101? 文献标志码： A? ：1002-1302（2019）12-0182-04 红心萝卜别称胭脂萝卜，是十字花科萝卜属萝卜种中的一个地方品种，在1979年蔬菜品种调查中确认为重庆涪陵特产[1]。红心萝卜具有心皮全红、色泽鲜美的特点，用以制作泡菜、萝卜干等，口感清脆。此外在红心萝卜中提取的红色素不仅可以作为食品添加剂，还具有抗氧化、抗痛风等功效，其应用前景广阔。涪陵红心萝卜在涪陵及周边区县均有栽种，是非常具有地方特色的蔬菜品种。但由于人们长期以来的自繁自种及红心萝卜与其他萝卜品种容易相互授粉，紅心萝卜的一些优良性状已逐步退化，如红心性状普遍退化，亟待人们对其色素合成相关基因展开研究，以保护和利用这一特色农业资源。目前人们对于涪陵红心萝卜的研究主要集中在新品种选育[1-3]、相关性状关系[4-6]与萝卜红色素的提取工艺[7-8]等方面，而关于基因表达量与色素含量之间的关联性分析报告较少。二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）是植物花青素合成途径中的关键酶，它在不同植株间具有高度的同源性。DFR基因为保守基因[9-10]，其表达存在时空差异性[11]，并且受多种因素的限制，如GA、NaCl、光照和UV-A等[12-14]。尽管DFR基因的相关特性及其在色素合成过程中的重要作用已逐渐为人所知，但其在红心萝卜色素合成中的作用尚不清楚。本研究通过分析DFR基因在不同肉质颜色萝卜中的表达差异，探寻DFR基因与萝卜肉质根颜色形成的关系，从分子水平解析红心萝卜红色素合成的机制，对改善红心萝卜优良性状、提高其利用价值具有重要意义，为通过基因工程手段提高红心萝卜的萝卜红色素含量提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 供试材料 试验选用16份来自长江师范学院的不同肉质颜色萝卜品种，材料编号及相关表型性状见表1。 1.2 试验方法 1.2.1 试验设计 于2015年9月至2016年1月在长江师范学院试验地进行田间试验，采用随机区组设计，设置2次重复，每个品种种植3行，每行12株，行距50 cm，株距33 cm。2015年9月23日播种，2015年9月30日出苗，出苗后 100 d，进行色素含量测定和肉质根总RNA的提取，每个处理取中间10株获取数据资料。 1.2.2 萝卜肉质根色素含量的测定 16个不同肉质颜色萝卜品种肉质根的色素含量依照吕发生等提出的方法[15]提取测定，其操作步骤如下：（1）称取柠檬酸16.958 0 g、磷酸二氢钠13.500 0 g配制成pH值为3.0的缓冲液1 000 mL，称取萝卜红色素 0.205 2 g，加入95 %乙醇1 mL为标准品溶液。然后分别吸取标准品溶液1～13 mL并用缓冲液定容至 100 mL，在 520 nm 处测吸光度，绘制标准曲线。（2）将新鲜肉质根清洗、擦干，切成小颗粒充分混匀，立即称取鲜样测定肉质根含水量，余下部分用浆渣自动分离机获取汁液，搅匀之后取8～10 mL汁液在离心机中以 4 000 r/min 离心5 min，离心完成后汲取1 mL上清液，用磷酸二氢钠缓冲液定容到 100 mL，然后在分光光度计中检测520 nm波长下的吸光度。（3）1 000 g新鲜肉质根的萝卜红含量C鲜（‰）=v×y。其中，汁液容积v（mL）=1 000×肉质根含水量（%）;汁液浓度y（g/mL）由标准曲线的回归方程计算。 1.2.3 萝卜肉质根总RNA的提取 本次萝卜肉质根总RNA提取方法参照柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒（SK8661）提取，试剂盒组成成分（表2）及具体操作步骤如下。 首先按照试剂盒说明在GT溶液、NT溶液中加入相应量的无水乙醇，混合均匀后在室温下密封保存备用，每次