不同浓度黄芩苷对高毒力肺炎克雷伯菌生长及生物被膜形成能力影响的初步探讨.docx

? ? 不同浓度黄芩苷对高毒力肺炎克雷伯菌生长及生物被膜形成能力影响的初步探讨 ? ? 韩佳慧 刘唐娟 罗劲 黄海珠 陈一强 肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, Kp)是临床上重要的条件致病菌，主要分为经典肺炎克雷伯菌(clinical Klebsiella pneumoniae , cKp)和高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae , hvKp)，hvKp能够在年轻的健康宿主中引起严重的、危及生命的社区获得性感染，包括肝脓肿、肺炎、脑膜炎和眼内炎等[1-2]。hvKp可在医疗植入物或组织表面形成生物被膜，从而增强对宿主防御因子和抗菌药物的抵抗能力[2]。生物被膜的形成常导致慢性、难治性的感染，为临床治疗带来了巨大挑战，使得寻找新型有效的抗菌药物成为一个研究热点。本研究拟探讨黄芩苷对hvKp生长及生物被膜形成能力的干预作用，以期为开发新型抗菌药物提供一定的理论依据。 资料与方法 一、试验材料 1 菌株 收集2019年10月-2021年2月于我院临床微生物检验鉴定中心鉴定的Kp。目前，关于hvKp的定义尚无统一标准，本研究根据拉丝试验阳性结果伴有临床侵袭性表现来定义hvKp，根据此方法从收集的临床菌株中筛选出编号为hvKp3的实验菌株，以Kp ATCC43816作为质控菌株。(拉丝试验[3]：用接种环轻触琼脂平板上的菌落，若有黏液丝且拉丝长度>5mm，即为拉丝试验阳性。) 2 主要试剂 黄芩苷粉剂购自成都麦德生科技有限公司，MHA培养基、MHB培养基、二甲基亚砜、结晶紫均为北京索莱宝科技有限公司。 二、仪器与设备 生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)，T6新世纪紫外分光光度计，THZ-82振荡器(常州智博瑞仪器制造有限公司),VARIOSKAN LUX酶标仪(德国Thermo Fish有限公司)。 三、实验方法 1 菌悬液制备 挑取hvKp3单个菌落接种到5 mLMHB培养基中，于37℃恒温水浴摇床中培养16～18h。用紫外分光光度计将过夜培养的菌液调至为OD600=0.1(约3×108cfu/mL)的菌悬液。 2 最低抑菌浓度(MIC)的测定 采用肉汤微量稀释法测定黄芩苷对hvKp3的MIC，ATCC 43816作为质量控制。MIC定义为通过肉眼直接观察，无细菌生长的最低药物浓度。 3 细菌动态生长曲线的测定 取500μL上述菌悬液加入24孔板中，同时加入500μL黄芩苷药液，使各组药液终浓度分别为MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC,以不加黄芩苷的MHB培养基作为空白对照组，37℃、220 r/min恒温水浴摇床中培养，每隔2h用酶标仪测定培养液600nm处吸光度(OD)值, 每组设置3个复孔，连续观察24h，绘制细菌生长曲线。 4 抑菌率曲线的测定 取500μL上述菌悬液加入48孔板各孔中，然后再分别加入500μL黄芩苷药液，使各组药液终浓度分别为MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，同时以不添加黄芩苷的MHB培养基作为阳性对照，以不含菌液的MHB培养基作为阴性对照，每组作3个复孔。于 37℃恒温培养箱中过夜培养，用酶标仪检测波长 600 nm下各孔内液体的吸光度值(OD)，并计算各组的抑菌率。 抑菌率计算公式如下：抑菌率%=(ODr-OD/ODr-ODb)×100%。式中：ODr：阳性对照组的吸光值，ODb：阴性对照组的吸光值，OD：黄芩苷组的吸光值。分别统计黄芩苷的抑菌率，并绘制抑菌率曲线。 5 抑制生物被膜形成实验 取500μL上述菌悬液加入48孔板中，并分别加入500 μL黄芩苷药液，使各组药液终浓度分别为MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，以不加黄芩苷的MHB培养基作为空白对照组，每组做3个复孔；37℃恒温培养箱静止培养24h后，行结晶紫半定量生物被膜形成及生物被膜内活菌菌落计数。 以上试验均独立重复3次。 四、统计分析 结 果 一、MIC的测定结果 黄芩苷对hvKp3、ATCC43816的MIC均为2048 μg/mL。 二、黄芩苷对hvKp3体外生长的影响 1 黄芩苷对hvKp3生长曲线的影响 采用24h细菌动态生长曲线法，研究1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和MIC 四种不同质量浓度的黄芩苷对hvKp3生长的影响，以MHB培养基作为空白对照，试验结果(见图1)。如图所示，四种不同质量浓度的黄芩苷均可减缓细菌的生长速度，具有明显的抑菌作用。 图1 黄芩苷对hvKp3生长的影响 2 黄芩苷对hvKp3的抑菌试验 采用抑菌率曲线测定的方法，研究1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和MIC 四种不同质量浓度的黄芩苷对高毒力肺炎克雷菌体外生长的影响，试验结果(见图2)。黄芩苷对hvK