细胞培养基本技术全面知识普及演示文稿.ppt

电子细胞计数器 当前第94页\共有137页\编于星期四\21点 细胞计数板 深度1mm，每个大方格是0.1mm3 当前第95页\共有137页\编于星期四\21点 细胞计数操作 制备单细胞悬液，吹打均匀后，转移一小部分样本（500ul）至1.5mlEP管中，加入等体积0.4％台盼蓝染液。 75％酒精清洗计数板表面，注意不要划伤计数表面。 将已染色待测细胞悬液吹打均匀，然后用移液器吸取20ul细胞悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，液体刚好流到计数板凹槽边缘。注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 将计数板平放在显微镜载物台上计数。 当前第96页\共有137页\编于星期四\21点 原代培养策略 当前第62页\共有137页\编于星期四\21点 原代培养——分离小鼠胚胎 当前第63页\共有137页\编于星期四\21点 原代培养——分离鸡胚 当前第64页\共有137页\编于星期四\21点 原代培养——酶解组织 当前第65页\共有137页\编于星期四\21点 内 容 细胞培养的理论背景 设备与器材准备、溶液配制 无菌技术 原代培养 传代培养 细胞计数与生长曲线 冻存、复苏与运送 常见问题及对策 当前第66页\共有137页\编于星期四\21点 概念——“代” 细胞分裂一次？ 错！ 培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。 当前第67页\共有137页\编于星期四\21点 传代培养的要诀（一） 该出手时就出手！ 该换液时就要换液，该传代时就要传代！ 否则，细胞就不是那个细胞 细胞会衰退、分化、生长缓慢…………，多数情况下很难扭转和补救。 当前第68页\共有137页\编于星期四\21点 传代培养的要诀（二） 勤观察 每天肉眼观察培养基颜色是否异常，有无混浊 观察培养基颜色变化速度是否异常：变化过慢意味着细胞生长过于缓慢；变化过快而细胞密度并不大，表明有污染的可能性。 镜下观察细胞形态、生长速度。 观察培养箱水盘中的水是否干净。 观察CO2压力表。 观察液氮罐内液氮体积 当前第69页\共有137页\编于星期四\21点 传代培养的要诀（三） 严格无菌操作 轻柔：避免机械力损伤细胞，重悬细胞时尽量用50ml离心管，通过晃动离心管分散细胞，尽量避免过力吹打。离心力不可超过300g（普通台式离心机水平转子1000rpm）。 快速：防止因过分小心导致操作时间过长，增加污染概率。 当前第70页\共有137页\编于星期四\21点 每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 平台期 当前第71页\共有137页\编于星期四\21点  每代贴附生长细胞的生长过程 游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时 贴壁期：血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） 潜伏期：此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 机制：接触抑制、密度抑制。尽量避免细胞进入平台期。 当前第72页\共有137页\编于星期四\21点 何时换液？ pH降低。培养基颜色由红变橙要警惕，变成黄色之前一定要换液。pH降至6.5时，细胞停止生长；降至6.0，细胞失去活性。无法挽救。 发现细胞出现形态衰退时须勤换液 若培养物密度过低或者生长缓慢，则更换一半培养基。 当前第73页\共有137页\编于星期四\21点 贴壁细胞换液的操作 吸出或倒出旧培养基。 加入同体积新培养基。 当前第74页\共有137页\编于星期四\21点 悬浮细胞换液操作 将培养液移入离心管中 1000rpm×5min 离心 弃上清 加入新培养基重悬细胞。 移入培养瓶，继续培养。 当前第75页\共有137页\编于星期四\21点 何时传代？ 在对数生长末期传代 不可在潜伏期传代 当前第76页\共有137页\编于星期四\21点 贴壁细胞何时传代？ 细胞密度，90％汇合度。若继续放置超过24h，细胞将脱离细胞周期，再接种需要很长时间才能恢复。 须频繁更换培养基时。 理想的传代频率：1:2～1:4传代，接种密度104～105/ml， 每7天传代一次。 常规传代最好依据严格的时间表进行。 当前第77页\共有