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表型确认金属--内酰胺酶的四种方法的比较 金属-内酰胺酶（pml），也称为金属酶。这是一组活动性部位为金属离子的酶，这些物质必须依赖于金属离子的存在，才能发挥诱导活动的作用。这是革兰氏阴性细菌对氨基丙烯酸和内酰胺类抗生素的抗性最重要的机制。近年来由于临床用药不合理,从医院分离的含金属β-内酰酶的菌种明显增加 1 材料和方法 1.1 细菌分离和鉴定 7株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)分别分离自本院ICU室和呼吸科患者的痰标本,对亚胺培南耐药。7株细菌由法国生物梅里埃公司VITEK-32型全自动微生物鉴定及药敏系统进行鉴定及药敏试验。质控菌大肠埃希菌(ATCC25922)购自卫生部临床检验中心。 1.2 pcr扩增检测 VITEK-32全自动鉴定及药敏系统及配套药敏卡、二氧化碳培养箱、深低温冰箱、PCR扩增仪和电泳仪等。Muller-Hinton(MH)琼脂为Oxoid公司产品;TaKaRa DR001A Taq酶为上海(大连)宝生物公司产品;DNA marker为Ta KaRa公司产品;引物由上海生工公司合成。 1.3 复方-吡啶-内酰胺-内酰胺-内酰胺-内酰胺bz、环丙沙星bz、头孢他啶-乙酸酯类 阿米卡星(AN)、氨苄西林(AM)、庆大霉素(GM)、妥布霉素(TM)、哌拉西林/他唑巴坦(P/T)、头孢唑林(CZ)、头孢吡肟(FEP)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢西丁(FOX)、头孢呋辛(CXM)、头孢曲松(CRO)、头孢哌酮(CFP)、氨曲南(AZT)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVF)、复方新诺明(SXT)、亚胺培南(IPM)、美罗培南(MPN)、头孢哌酮/舒巴坦(C/S)。IP/IPI E-test纸条由先声药业有限公司馈赠。 1.4 方法 1.4.1 药物过敏试验 1.4.2 改善hough-key试验 1.4.3 纸扩散法 1.4.4 e-测试纸的检测方法 1.4.5 双纸的合作测试 1.4.6 pcr扩增 根据文献和基因库检索 反应体系为:10×PCR缓冲液2.5μL,dNTP2μL,引物1和引物2各0.5μL,TaqDNA聚合酶0.2 U,扩增模板液0.5μL,ddH 2 结果 2.17 耐药情况对氨基糖苷类药物耐药率的影响 7株KP对氨苄西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、头孢呋辛、头孢曲松、头孢哌酮、氨曲南、环丙沙星、左氧氟沙星、亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦的耐药率均为100%;而对氨基糖苷类药物较为敏感,对阿米卡星、庆大霉素和妥布霉素的敏感率分别为100%、71.43%和71.43%;对复方新诺明的敏感率为85.71%。 2.2 hough试验的改进 7株KP均为阳性。 3号菌KP阳性.其余均为阴性。 3号菌KP阳性,其余均为阴性。见图1 2.5 双纸合作试验的结果 3号菌在d=10 mm时为阳性,d=15 mm时为阴性,其他菌均为阴性。 2.6 pcr试验的结果 详见表1及图2、图3。 2.74 表2显示了在不同方法下检测mll的结果的比较 3 pcr方法 本次研究,研究人员用了4种不同的表型检测方法对金属-β-内酰胺酶进行检测并将PCR方法作为对照,对其进行方法学评价。改良Hodge试验操作简便、成本低廉,一般实验室都能开展。阳性结果只能确定其是否产碳青霉烯酶,金属酶属于碳青霉烯酶的一种 纸片扩散法操作简便、成本低廉,其中所用的EDTA抑制剂为各实验室自己配制,不同实验室之间会有误差。同时,若按照某些参考文献所定标准为二者直径之差大于5 mm即为阳性,则假阳性太多。经本次试验证明,并经分子生物学确认,二者直径之差≥8 mm为阳性,则为最适判断标准。 E-test纸条检测法中所用纸条为商品化试剂,质量稳定,容易保存。该方法操作简便、结果准确且易观察,但成本较高,E-test纸条在国内不易获得。该方法是临床实验室表型确认金属酶的最好方法。有条件的实验室可以常规备用。 双纸片协同试验,实验操作简单,但检测结果与两纸片之间的距离紧密相关。有文献报道 PCR方法检测MBL应为确认方法,该方法准确、可靠。但此实验要求较高,需要有相应的设备和试剂,适合科研,不适合实验室常规检测。 本实验对IMP、VIM、SPM、GIM和NDM-1五种金属酶基因进行了检测,只检测出VIM基因。VIM基因是在我国检出的主要金属酶基因型,这与相关报道一致 目前研究认为,肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素的主要机制与产AmpC酶合并外膜蛋白的丢失、金属酶、OXA和KPC型β-内酰胺酶等多种因素有关 分别用KB法及VITEK GNS-448卡对KP进行药敏试验,药敏判读标准为CLSI2010年版标准。 将大肠埃希菌ATCC25922菌液调成0