《基质辅助激光解吸电离飞行时间核酸质谱法体细胞突变检测通则》.docx

Q/LB.□XXXXX-XXXX PAGE 2 ICS 11.040.01 CCS N 54 T/CRHA XXX—XXXX 基质辅助激光解吸电离飞行时间核酸质谱法体细胞突变检测通则 Method of somatic mutation detection for matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry （征求意见稿） XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中国研究型医院学会?发布 团体标准 STYLEREF 标准文件_文件编号 T/CRHA XXX—XXXX PAGE 2 基质辅助激光解吸电离飞行时间核酸质谱法体细胞突变检测通则 范围 本文件为实验室利用飞行时间核酸质谱平台进行肿瘤个体化用药基因或肿瘤良恶性辅助诊断基因的体细胞突变检测提供技术指导。 本文件适用的样本类型包括新鲜肿瘤组织、肿瘤组织或者细胞石蜡包埋切片。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 T/ZZB 2482-2021 飞行时间核酸质谱仪 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 引物（Primer） 结合于模板链上，引导聚合酶进行延伸的起始位点或终止位点的，具有一定长度和顺序的寡核苷酸。 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Ceaction） 聚合酶链反应或多聚酶链反应是一种在体外对模板DNA或RNA的特定片段进行快速扩增的方法，包含变性退火延伸三个基本反应步骤。 单碱基延伸（Single Base Extension） 适宜的反应体系中，在延伸引物引导下，聚合酶以ddNTP或者acyNTP为底物仅延伸单个碱基，常用于DNA sequencing和SNP检测。 体细胞突变（Somatic Mutation） 体细胞突变是相对于胚系突变而言的，发生在体细胞中的突变，即在体细胞发生了基因突变或染色体畸变，突变性状一般不能传给下一代个体，却可以引起当代某些细胞的遗传结构发生改变的突变。此文的体细胞突变指单碱基突变。 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） SAP：虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） dUTP：脱氧尿苷三磷酸（2'-deoxyuridine 5'-triphosphate） ddATP：2',3'–二脱氧腺苷 5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-adenosine-5'-triphosphate） ddGTP：2',3'-二脱氧鸟苷 5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-guanosine-5'-triphosphate） ddCTP：2',3'-二脱氧胞苷 5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-cytidine-5'-triphosphate） ddTTP：2',3'-二脱氧胸苷 5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-thymidine-5'-triphosphate） UDG：尿嘧啶DNA糖基酶（Uracil-DNA Glycosylase） 原理 提取纯化获得DNA模板，通过PCR扩增出含有突变位点的一段靶序列，经SAP消化去除扩增产物中多余的dNTP，加入序列特异性延伸引物（其3’端碱基紧挨突变位点）和突变位点特异性的末端终止碱基,这样，突变位点在延伸酶的作用下进行单碱基延伸，而野生型位点得不到延伸，富集突变含量，延伸产物经过脱盐纯化后，转移至带有基质的载体上，使用MALDI-TOF对延伸产物进行检测，通过质荷比信号分析确定模板中是否存在突变。基于本原理，可检测出10ng DNA样品中含量低至1%的突变。 试剂与耗材 除另有规定，所用试剂均为分析纯。也可根据自身实验需求，选择其他型号的同等功能的耗材和试剂。推荐试剂与耗材如下： 10x PCR 缓冲液； 50 mmol/L 氯化镁溶液； 25 mmol/L dNTP/dUTP Mix； 5 U/μL DNA聚合酶； 5 U/μL UDG； 18 MΩ*cm@25℃的纯化水； 10x SAP缓冲液； 1.7 U/μL SAP酶； 10x延伸缓冲液； ddATP Mix； ddGTP Mix； ddCTP Mix； ddTTP Mix； 单碱基延伸引物； 延伸酶