细菌内毒素检查法讲稿详解演示文稿.ppt

* 凝胶法干扰试验 导致干扰的因素： pH值 抗凝因子 螯合剂 葡聚糖 ……. 当前第63页\共有89页\编于星期四\10点 * 凝胶法干扰试验 排除干扰的方法： 稀释 中和 过滤 加热 …… 当前第64页\共有89页\编于星期四\10点 * 凝胶法干扰试验 为确保所选择的处理方法能有效的排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。 即，先在供试品溶液中添加2λ浓度的标准内毒素，然后用所选择的方法处理溶液，而后再进行稀释、检测。 当前第65页\共有89页\编于星期四\10点 * 凝胶法干扰试验 由于干扰实验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰实验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。 建议使用较低灵敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰实验造成的阳性影响。 当前第66页\共有89页\编于星期四\10点 * 4、确定最大有效稀释倍数（MVD） 计算举例： b、当L以EU/mg或EU/U表示时，浓度c的单位需为mg/ml或U/ml 。 适用于供试品为固体状态，如粉针；或液体但是规定限值为应小于xx EU/mg或EU/U 。 当前第31页\共有89页\编于星期四\10点 * 4、确定最大有效稀释倍数（MVD） 例：注射用阿莫西林钠  计算限值为0.15 EU/mg，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验。 需先称取一定重量的注射用阿莫西林钠 ,在已除去外源性内毒素的容器中,用细菌内毒素检查用水配制成一定浓度的溶液。 如称取100mg注射用阿莫西林钠 ，用5ml内毒素检查用水溶解，即成为浓度为20mg/ml的阿莫西林钠溶液。 MVD=20mg/ml?0.15 EU/mg÷0.125 EU/ml=24倍 当前第32页\共有89页\编于星期四\10点 * 4、确定最大有效稀释倍数（MVD） 如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L； 适用于供试品为固体的情况。计算得到的最小有效稀释浓度即为MVD下的该供试品的浓度。 例：注射用阿莫西林钠  计算限值为0.15 EU/mg，使用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂进行检验。 最小有效稀释浓度c= 0.125EU/ml÷0.15EU/mg=0.833mg/ml  当前第33页\共有89页\编于星期四\10点 * 细菌内毒素检查----------凝胶法 2、实验部分 鲎试剂灵敏度复核 干扰实验：预实验 正式干扰实验 检 查 法：限量试验 半定量试验 当前第34页\共有89页\编于星期四\10点 * 鲎试剂灵敏度复核试验 目的：不仅是考察鲎试剂灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。 要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 当前第35页\共有89页\编于星期四\10点 * 鲎试剂灵敏度复核试验 实验操作: 取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。 然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。 当前第36页\共有89页\编于星期四\10点 * 鲎试剂灵敏度复核试验 内毒素浓度 2λ λ 0.5λ 0.25λ 阴性对照 鲎试剂 平行管 当前第37页\共有89页\编于星期四\10点 * 鲎试剂灵敏度复核试验 放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形或从管壁滑脱者为阴性。 保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当前第38页\共有89页\编于星期四\10点 * 坚实凝胶