生物学实验报告.docx

第 第 PAGE 1 页 共 NUMPAGES 1 页 生物学实验报告 　　姓名：***学号：2022001400**班级：20**级生物基地班 试验日期：2022年9月16日—30日组别：6组 同组者：**　　一、【试验目的】　　1、掌控碱变性提取法提取大肠杆菌中质粒DNA的原理和方法。　　2、学习并掌控凝胶电泳进行DNA的分别纯化的试验原理。　　3、学习并掌控凝胶的制备及电泳方法。　　4、学习并掌控凝胶中DNA的分别纯化方法。　　二、【试验原理】　　1、质粒DNA的制备方法　　质粒〔Plasmid〕是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1～200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。　　质粒DNA的制备包括3个步骤：①培育细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分别和纯化质粒DNA。主要方法包括：碱裂解法：0。2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，一般用于质粒大量提取。在实际操作中可以依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本试验选择碱裂解法提取质粒DNA。　　2、质粒DNA的提取——碱变性提取法　　在细菌细胞中，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依靠的溶pH值不同。在pH值高达12。0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分别。由于它们在拓扑学上是相互缠绕的。当用pH值4。6的KAc〔NaAc〕高盐溶液调整碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可复原原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分别。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝集而形成沉淀。由于DNA和RNA性质类似，乙醇沉淀　　DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最末获得纯度较高的质粒DNA。　　3、凝胶电泳进行DNA分别纯化　　电泳〔electrophoresis〕是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在肯定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区分各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分别、鉴定和纯化DNA的片段，是分子生物学的核心技术之一。　　凝胶电泳技术操作简约而快速，辨别率高，辨别范围广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭〔ethidium bromide，EB〕或SYBR Gold染色径直观测到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能径直检测到。需要的话，这些分别的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各式各样目的的试验。　　分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖〔agarose〕和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种外形、大小和孔径，也能以很多不同的构型和方位进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶辨别率高，运用于较小分子核酸〔5—500bp〕的分别和蛋白质电泳。它的辨别率特别高，长度上相差1bp或质量上相差0。1%的DNA都可以彼此分别，这也是采纳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由β—D—吡喃半乳糖与3，6—脱水—L—吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104—105。琼脂糖加热至90℃左右，即可溶化形成清亮、透亮的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40—45℃。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶辨别率低，但它的分别范围更大〔50至百万bp〕，小片段DNA〔50—20000bp〕最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分别。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分别经限制酶水解的DNA的片段，进一步纯化DNA等。　　琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决