杨属转基因植物PCR检测内标准基因的建立.pdf

杨属转基因植物 PCR 检测内标准基因的建立 刘海涛;张川红;马淼;郑勇奇 【摘要】为了建立适用于杨属植物转基因成分 PCR 检测的内对照系统,利用目前 genebank 中已公布的杨属植物的叶绿体 DNA rbcL 基因的保守区域,设计了两对 PCR 引物:rbcL-1 引物和 rbcL-2 引物,分别成功地对五大派 10 种杨属植物进行了 rbcL 基因片段的扩增,第一次建立了适用于杨属植物转基因成分 PCR 检测的内标准 基因对照系统.其中 rbcL-1 引物适用的退火范围很广,在 52.0 ～68.0℃之间均能得 到特异性很强的扩增产物,这有利于其他检测项目(如 35S 启动子、NOS 终止子、 标记基因及目标基因)的引物随意搭配进行多重 PCR 检测,从而提高检测效率、缩 短检测周期. 【期刊名称】《广东农业科学》 【年(卷),期】2010(037)003 【总页数】4 页(P208-211) 【关键词】杨属;rbcl 基因;转基因检测;内标准基因;PCR 【作者】刘海涛;张川红;马淼;郑勇奇 【作者单位】中国林业科学研究院林业研究所/国家林业局林木培育重点实验室,北 京,100091;国家林业局植物新品种分子测试实验室,北京,100091;石河子大学生命 科学学院,新疆,石河子,832003;中国林业科学研究院林业研究所/国家林业局林木培 育重点实验室,北京,100091;国家林业局植物新品种分子测试实验室,北京,100091; 石河子大学生命科学学院,新疆,石河子,832003;中国林业科学研究院林业研究所/国 家林业局林木培育重点实验室,北京,100091;国家林业局植物新品种分子测试实验 室,北京,100091 【正文语种】中 文 【中图分类】Q343.2~+2 近年来，转基因生物技术已在林木遗传育种领域得到了广泛的应用，大大推动了林 木遗传改良和新品种的选育。据不完全统计，全球范围内现已对近百个树种进行了 遗传转化，其中杨树、番木瓜（Caricaceae ）、松树（Pinus spp. ）、柳 （Salix spp. ）、核 桃 （Juglus regia ）、苹 果（Malus ）、樱桃 （Prunus ）、香樟 （Camphora ）、悬铃木（Plantnus ）、桉树（Eucalyptus spp. ）、云杉 （Picea spp. ）等转基因植株已经进入田间试验阶段或已经批准商品化[1-3]。由 于林木具有树体巨大、生活周期长、天然群体分布广等特点，相对于农作物来说转 基因林木可能存在的生态安全性问题更加复杂和难以预料 ，也引起人们更多的担忧 与关注[4]。针对公众的担心与疑虑 ，目前全球已有 30 多个国家制定了法律法规对 转基因植物及其衍生品进行标识。当前国际上转基因产品的检测方法主要是基于插 入的外源基因和表达产物的基础上 ，包括 DNA 检测方法和蛋白质检测方法。聚合 酶链式反应（Polymerase chian reaction ，PCR ）作为一种快速 ，灵敏的的核酸 检测方法 ，在转基因产品的检测上已经得到广泛的认可和应用 [5-7]。但 PCR 检测 灵敏 ，易受 DNA 污染 ，容易出现假阳性 ，假阴性结果。在检测时 ，通常需要设立 一系列对照 （内标准基因对照、阳性 PCR 对照、阴性 PCR 对照、PCR 空白对照、 阴性提取对照等）以排除假阳性与假阴性。其中，内对照的设立可用于对基因组中 某一目的基因定量分析和验证 PCR 反应体系中是否存在抑制物质 ，衡量模板 DNA 质量及确定外源基因的拷贝数。目前 ，有关内标准基因的研究主要集中在农作物上： 如转基因大豆的检测一般选 lectin （凝集素）基因作为内标，转基因玉米检测一般 以 invertase （转化酶）基因或zein （玉米醇溶蛋白）基因为内标；而转基因水稻 的检测则选择 sps （蔗糖磷酸合酶）或gos （一个水稻根部表达的基因）基因作为 内标准基因[8-9] ，其它植物转基因成分检测的内标准基因的研究尚未见报道。 目前，国内外对转基因林木的研究主要集中在杨属（Populus ）植物。杨属植物是 全球范围内普遍分布的森林树种，也是木本植物生理学、分子生物学和基因工程研 究的模式植物。笔者统计了中国近年来木本植物所做的遗传转化研究后发现，近 50 种树种中有超过一半是针对杨属植物的[10]。因此，建立针对杨属植物的通用 内标准基因对照系统是十分必要和有意义的。一般而言 ，比较保守的功能基因的