多菌灵降解菌株djl-10的分离及降解特性-《江苏农业科学》(2019年23期).docx

龙源版权所有 多菌灵降解菌株djl-10的分离及降解特性作者：袁巧云 孙悦 张迹来源：《江苏农业科学》2019年第23期 摘要：从多菌灵生产废水处理系统中，通过富集和选择性培养，分离得到1株能高效降解多菌灵的细菌，并将其命名为djl-10。根据菌株的菌落形态，生理生化特性及基于16S rDNA序列的系统发育分析等，初步将菌株鉴定为分枝杆菌属。该菌株能利用多菌灵作为唯一碳源、氮源进行生长并基本彻底矿化多菌灵。2-氨基苯并咪唑和2-羟基苯并咪唑为菌株降解多菌灵的中间代谢产物。菌株能够在较宽温度和pH值范围内有效降解多菌灵，其降解多菌灵的最适温度和pH值分别为37 ℃、7.0。装液量试验结果表明，菌株djl-10对多菌灵的降解明显依赖氧气。Ca2+、Mg2+、Fe3+等离子能够明显促进菌株djl-10对多菌灵的降解。此外，本研究克隆和表达菌株djl-10的多菌灵水解酶基因mhe。酶促反应结果表明，纯化的重组酶Mhe对多菌灵具有明显的催化活性。 关键词：分枝杆菌;多菌灵;生物降解;废水处理系统 中图分类号：X172 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）23-0284-05 多菌灵是一种广谱、内吸性杀菌剂，广泛应用于防控各种农作物的真菌病害[1]。许多苯并咪唑类和托布津类杀菌剂均可在作物体内转化为多菌灵而起作用[2]。多菌灵同时还是一种持久性环境污染物，其半衰期在表层土壤中约为3～15周[3-4]。值得注意的是多菌灵在土壤和水体中长期残留会进一步污染食品，危害人们身體健康[5-6]。研究表明，多菌灵对动物的肝脏和内分泌系统有害，是一种“三致”物质，既使在较低浓度下也会对生物体造成伤害[7-8]。我国每年多菌灵的生产量已超过10 000 t[9]。经生产和使用途径多菌灵进入环境中，并在土壤、河流中残留，对各种生物的生长繁殖以及人们的食品安全和身体健康造成潜在的危害。目前，已经报道多种多菌灵降解菌株[7-12]。本研究分离得到1株能高效降解多菌灵的分枝杆菌菌株，并对其降解特性进行初步研究，以期进一步丰富高效多菌灵降解菌株的资源库。 1 材料与方法 1.1 化学试剂与培养基 多菌灵（纯度>98.0%），由江苏新沂农药厂赠送;用于高效液相色谱分析的色谱纯甲醇，购自江苏汉邦科技股份有限公司。其他化学试剂均为普通国产分析纯试剂。 基础盐（MSM）培养基配方：1.0 g/L NaCl，1.0 g/L NH4NO3，1.5 g/L K2HPO4，0.5 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O，1 000 mL 去离子水;富集分离培养基：在基础盐培养基中添加0.01%的多菌灵原药作为唯一碳氮源;LB培养基配方：10.0 g/L 胰蛋白胨，5.0 g/L酵母粉，5.0 g/L NaCl，1 000 mL 去离子水。 1.2 菌株的富集与分离 取多菌灵生产废水处理系统中的5 mL活性污泥加入到100 mL富集培养基中，在30 ℃，180 r/min条件下振荡培养。每隔4 d取5 mL富集培养物接种至100 mL新鲜富集培养基中。经连续3代富集后，取富集液梯度稀释涂布到含过饱和多菌灵的基础盐琼脂平板上，30 ℃培养3 d。周围有透明圈的菌落即为疑似多菌灵降解菌，将这些菌株用固体LB培养基平板划线分离，纯化后进一步验证其多菌灵降解能力。 1.3 菌株鉴定 采用高盐法提取菌株基因组DNA作为模板，以细菌16S rDNA通用引物PCR扩增菌株16S rDNA序列。PCR扩增产物TA克隆后，转化大肠杆菌 DH5α菌株感受态细胞，挑选阳性转化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序序列提交到NCBI（）上进行在线分析，利用Blast软件在GenBank中与其他菌株16S rDNA序列进行同源性比对。采用软件Mega 6.0，通过邻结法构建系统进化树。菌株djl-10 16S rDNA序列的GenBank登录号为KX509812。 1.4 多菌灵降解及检测 1.4.1 菌悬液制备 接种菌株dj1-10至液体LB培养基中，在30 ℃，180 r/min条件下振荡培养3 d，离心收集菌体，用MSM培养基洗涤并重悬菌体至D600 nm≈1.0。 1.4.2 降解体系构建 以1%的接种量，接种菌悬液至MSM液体培养基中，并添加终浓度为100 mg/L的多菌灵作为唯一碳源和能源。当以多菌灵为唯一氮源时，向降解体系中添加100 mg/L葡萄糖。所有处理均设置3次重复，在30 ℃，180 r/min 条件下振荡培养，按特定时间间隔取样待测。 1.4.3 样品处理 向待测样品中加入等体积二氯甲烷，剧烈振荡2 min，静置分层后吸出水相，有机相在通风橱中充分挥发后加甲醇重新溶解定容，用0.22 μm