养殖不同海水鱼的同种循环水系统中除磷细菌组成及特性-《江苏农业科学》(2017年12期).docx

龙源版权所有 养殖不同海水鱼的同种循环水系统中除磷细菌组成及特性作者：周胜杰 路斌 贾婷婷 李连星 张扬 刘兴 陈成勋 马志华来源：《江苏农业科学》2017年第12期 摘要：以点带石斑鱼（W池）、大菱鲆（D池）、红鳍东方鲀（H池）及半滑舌鳎（B池）4个鱼种循环水养殖系统净化池中采集水样为对象，采用平板分离法及液体培养法定量研究具有除磷能力的细菌及其特性。结果表明，4个系统中共培养16株除磷细菌；其中皮特不动杆菌、哈夫尼希瓦氏菌、创伤弧菌、副溶血弧菌具有较强的除磷能力和效果（皮特不动杆菌>创伤弧菌>哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌）；总除磷能力与细菌总浓度呈正相关；4种细菌去除NH4+-N效果为哈夫尼希瓦氏菌>副溶血弧菌>皮特不动杆菌>创伤弧菌；其中皮特不动杆菌、哈夫尼希瓦氏菌、创伤弧菌具有除TN能力，去除TN的效果为皮特不动杆菌>哈夫尼希瓦氏菌=创伤弧菌。 关键词：循环水养殖系统；细菌；除磷；氨氮；总氮 中图分类号： S967.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）12-0120-04 通信作者：陈成勋，研究员，主要从事水产动物增养殖学研究。E-mail：489699261@。随着海水集约化养殖模式的发展，饵料投放、养殖密度的提高使水体中营养盐污染问题突出，为循环水系统磷处理压力不断增加。目前，循环水系统中除磷工艺主要靠的是微生物的解磷作用。高效的解磷菌可以有效地缓解集约化循化水系统中的除磷压力。因此，筛选高效的除磷细菌成为了目前学者们的主要研究热点。微生物分解环节严重受阻，成为水体系统循环过程的制约条件，造成水体富营养化甚至污染，引发出诸多病害、药残、食品隐患等问题。当前，对养殖水体除磷方式的研究包括物理法、化学法、植物法（藻类、水草）、微生物学方法[1-6]，其中对不同养殖种类的集约化循环水养殖系统中除磷细菌的种类及多样性特征的报道较少。本研究以点带石斑鱼、大菱鲆、红鳍东方鲀和半滑舌鳎4种集约化养殖种类的同种循环水养殖系统作为研究对象，通过分离培养、筛选比较的方式进行除磷菌研究，从而寻找循环水养殖系统中除磷能力较高的除磷菌，了解其多样性特征，为集约化养殖循环水养殖系统的发展提供参考依据。 1材料与方法 1.1试验材料 以天津市海发珍品实业发展有限公司循环水养殖系统净化池为研究对象，对其中可培养性细菌进行分离提纯。 普通可培养性细菌通用培养基：琼脂15 g、NaCl 5 g、牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、蒸馏水100 mL，121 ℃高温灭菌15 min。 无机磷液体培养基[7]：NH4Cl 0.50 g、柠檬酸钠5.66 g、维氏盐溶液50 mL、蒸馏水100 mL，pH值7.0。 维氏盐溶液：K2HPO4 5.00 g、MgSO4·7H2O 2.50 g、FeSO2·7H2O 0.05 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、盐度为1.5%的卤水。 1.2主要仪器设备 振荡培养箱（BS-1E型，环宇科学仪器厂）；灭菌锅（TOMY SX500型，上海麦森医疗科技有限公司）；超净工作台（SW-CJ-2FD型，苏净安泰）；冷冻离心机（LEGEND MACH 1.6R型，Thermo）；紫外分光光度计（UVmini-1240型，东莞市塘厦众和电子仪器设备商行）；光学显微镜（Leica DM500型，德国莱卡）。 1.3方法将采集到的样本按10-3、10-4、10-5的浓度稀释，并取一定量的稀释液在普通用可培养性细菌培养基上涂布，24 ℃培养16～18 h。通过低倍显微镜观察菌落外形（例如：菌落形状、菌落颜色、边缘是否光滑、边缘线形状、内部纹理形状等）将菌落进行分类并标号，统计每1种细菌菌落的数目，推算出浓度。将区分开的菌落通过平板划线法进行充分分离纯化（3～4次），要求每一次都由单菌落进行划线。将分离纯化后的细菌通过16S rRNA进行测序。 利用无机磷液体培养基培养分离出的细菌24 h，测定无机磷含量变化同时测定氨氮与总氮的含量变化，计算其相关性。 1.4統计分析 所得数据在SPSS 19.0及Excel统计软件上进行处理。结果显示，细菌浓度、除磷能力、除氨氮能力和除总氮能力4个因素间没有显著相关性。而各循环水养殖池细菌总浓度与总除磷能力呈正比（r2=0.999）。 2结果与分析 2.1细菌种类鉴定与系统发育树分析 DNA分子的制备与分子发育树的制作参照文献[8]进行。 16S rRNA测序的通用引物：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。进行PCR扩增，将PCR产物送至测序公司（北京金唯智生物股份有限公司）进行纯化和测序。测序获得的16S rRNA基因序列长度为890～1 500