桑树SSR-PCR反应体系的优化-《江苏农业科学》(2019年14期).docx

龙源版权所有 桑树SSR-PCR反应体系的优化作者：刘玲 陈祥平 范小敏来源：《江苏农业科学》2019年第14期 摘要：为了建立经济稳定的桑树简单重复序列（SSR）-PCR反应体系，为SSR分子标记在桑树研究中更广泛地应用提供试验基础，采用L16（45）正交试验设计和单因素试验，对桑树SSR-PCR反应体系中的模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和rTaq酶用量5个因素的4个水平进行优化分析，并比较这5个因素的不同浓度对扩增效果的影响。结果表明，各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为Mg2+、dNTPs>引物>模板DNA>rTaq酶。研究最终确立了最佳反应体系，即在10 μL反应体系中，含有1.5 μL 10～20 ng/μL DNA模板、0.4 μL 25 mmol/L Mg2+、0.5 μL 2 mmol/L dNTPs、各0.15 μL 20 μmol/L正反向引物、0.1 μL 5 U/μL rTaq酶和1 μL 10×loading buffer。通过稳定性检测，表明该体系能够用于桑树的SSR分析。 关键词：桑树;正交试验设计;单因素试验;SSR-PCR反应体系优化 中图分类号： S888.2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）14-0045-05 桑树是桑科（Moraceae）桑属（Morus L.）的多年生木本植物，是重要的经济植物，桑叶是家蚕的主要饲料。我国地域辽阔，生态环境各异，经过长期的自然选择和人工选育，形成了非常丰富的桑树种质资源。因此，研究桑树的遗传多样性及其亲缘关系对桑树的栽培育种、良种选育等有重要意义。 简单重复序列（simple sequence repeats，简称SSR）DNA，又称微卫星DNA（microsatellite DNA），是由Moore和Terer等于1991年提出的，它是以1～6 bp核苷酸为重复单位而多次串联重复组成的DNA序列。SSR具有多态性高、试验操作简单、共显性等优点，被广泛应用于植物的分子连锁图谱构建、基因定位、品种遗传多样性和群体结构分析、纯度鉴定、杂种优势的预测等[1]。 SSR是一种基于PCR技术的分子标记，试验结果易受反应组分的影响，为了确保试验结果的准确性和重复性，建立和优化SSR-PCR反应体系是非常必要的。目前，应用SSR分子标记研究桑树种质资源遗传多样性等方面的报道较少，关于桑树SSR-PCR反应体系优化的研究仅见罗义维等报道的采用正交设计试验的优化过程[2]。本研究参考已有的桑树SSR研究[2-7]，采用正交试验和单因素优化试验结合的方法，对桑树SSR-PCR反应体系中的模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶5个因素的4个水平进行优化分析，以期建立经济、实用、稳定的反应体系，为SSR分子标记在桑树研究中更广泛地应用提供试验基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料 本试验材料采自四川省丝绸科学研究院桑树种质资源圃，详见表1。选择桑树品种丰台作为体系优化用的DNA模板。引物序列参照Aggarwal等的研究[8-10]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，详见表2。PCR反应所用的Mg2+、dNTPs、rTaq酶、DNA marker和10×loading buffer均购自TaKaRa公司。 1.2 方法 1.2.1 桑树总DNA提取及质量检测 桑叶总DNA采用2种方法从用0.15 g硅胶干燥的桑叶中提取，一种是稍加改进的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[11]，另一种是在用4×CTAB提取前，先用去糖缓冲液抽提。取3 μL提取的DNA样品，在1%琼脂糖凝胶中电泳20 min，电泳完毕后在WFH-201B紫外反射透射仪中观察DNA条带。利用KAIAO K5500微量紫外分光光度计检测DNA浓度，之后于-20 ℃保存。 1.2.2 PCR扩增及产物的电泳检测 PCR反应在Thermal Cycler（上海山富科学仪器有限公司生产）上进行。PCR反应体系总体积为10 μL，包括Mg2+、dNTPs、rTaq聚合酶、正反向引物、模板DNA和10×loading buffer。PCR反应程序参照赵卫国的报道[12]，采用降落PCR：95 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，63 ℃退火1 min，每个循环降低0.5 ℃，72 ℃延伸 1 min，16个循环;94 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，24个循环;72 ℃延伸5 min。反应结束后控制温度在 10 ℃。 将扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测。进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，在DYY-6C型稳压稳流电泳仪上，于200～220 V預电泳10～20 min。预电泳完毕