2024届高考一轮复习生物课件（苏教版）：PCR技术拓展应用.pptxVIP

PCR技术拓展应用解惑练4应用1：反向PCR测定未知DNA区域当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制性内切核酸酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。应用2：PCR定点突变技术该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。应用3：(实时)荧光定量PCR(RT－PCR) 先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA，并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小(如图)。跟踪训练1.如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T－DNA，要想对T－DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是A.用引物①和引物④直接进行 PCR 扩增之后再测序B.用引物②和引物③直接进行 PCR 扩增之后再测序C.用 DNA 连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR 扩增后测序D.用 DNA 连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR 扩增后测序√跟踪训练直接选用引物①、④组合进行PCR，引物选择方向相反，无法完成扩增，A错误；用引物②和引物③可实现对已知的T－DNA序列进行扩增，但达不到预期目的，B、D错误；用DNA连接酶连接成环状后，用引物①④PCR扩增后测序，恰好可扩增出T－DNA两侧的未知序列，C正确。跟踪训练2.重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。下列说法错误的是跟踪训练A.过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA 模板、引物、4种脱氧核苷三磷酸、 热稳定的DNA聚合酶等B.若引物1、引物2组成的反应系统和 引物3、引物4组成的反应系统中均 进行一次DNA分子的复制后，一共 会产生2种DNA分子C.经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目 的基因D.过程⑤使用热稳定的DNA聚合酶延伸，不需要引物√跟踪训练过程②为PCR反应，需要在添加了Mg2＋的缓冲液中才能进行，需要提供模板DNA、分别与两条模板链结合的引物、4种脱氧核苷三磷酸和热稳定的DNA聚合酶等，A正确；两个反应系统中各自形成两种DNA分子，但由于引物1和引物4形成两个与原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA属于同一种DNA，故总共形成3种DNA分子，B错误；跟踪训练过程④获得的杂交DNA有2种，一种3′端为单链，一种5′端为单链，5′端为单链的杂交DNA为所需DNA，C正确；过程⑤是延伸过程，该过程使用热稳定的DNA聚合酶进行催化，不需要引物，D正确。跟踪训练3.(2023·江苏泗洪县高三检测)基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重排等变异。右图甲是一种PCR介导的基因定点突变示意图，图乙是研究人员利用基因M1构建基因表达载体的过程。请回答下列问题：(1)进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入_______________________________；图甲所示的基因定点突变技术需要____次PCR；获得产物A需要的引物是_______________。Taq酶、dNTP(缓冲液、Mg2＋)等3′引物1和引物3跟踪训练进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入Taq酶、dNTP(缓冲液、Mg2＋)等。从图甲可以看到