运动疲劳对大鼠骨骼肌纤维GLUT4mRNA和蛋白表达的影响-《首都体育学院学报》(2017年2期).docx

龙源版权所有 运动疲劳对大鼠骨骼肌纤维GLUT4mRNA和蛋白表达的影响作者：龚云　王超来源：《首都体育学院学报》2017年第02期 摘要：探讨运动疲劳引起大鼠骨骼肌纤维GLUT4mRNA和蛋白表达的变化及其可能机制。方法：Wistar大鼠40只，随机选取10只为正常对照组（D组），其余采用多级递增负荷跑台运动建立运动疲劳模型，留其成功的20只为疲劳组（P组）；测试力竭运动后2组大鼠血糖、血尿素氮、血乳酸、血清胰岛素含量，采用逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）法测定股四头肌细胞GLUT4mRNA的表达，运用免疫组化法观测该部GLUT4蛋白的表达。结果：力竭运动后即刻，实验组大鼠血糖、血清胰岛素含量均显著低于（P 关键词：运动疲劳；骨骼肌纤维；GLUT4mRNA和蛋白表达；RT-PCR；免疫组化；大鼠 中图分类号：G 804.2 文章编号：1009-783X（2017）02-0182-06 文献标志码：A 在运动性疲劳外周机制的研究中，骨骼肌糖代谢是重要的聚焦点，其主要限速步骤是葡萄糖运载体4（GLUT4）介导的葡萄糖跨膜转运。有研究显示，GLUT4的表达从根本上决定了其转运葡萄糖的能力；而这种葡萄糖转运能力的高低，又直接影响骨骼肌纤维糖氧化供能的底物水平。巫菲等研究表明，慢性心力衰竭可致大鼠骨骼肌GLIT4mRNA表达显著降低。龚豪杰等的研究显示：2周低氧及低氧训练均能引起野生小鼠骨骼肌GLUT4表达的增多；1 h不同强度跑台运动后，野生小鼠骨骼肌GLUT4基因表达量显著增加。唐艳婕等研究结果显示，游泳训练使T2DM大鼠腓肠肌GLUT4蛋白表达增强。杨晓冰的研究认为，运动可以提高胞膜内GLUT4转运速率，且能够增加大鼠骨骼肌细胞内GLUT4的含量，并促进骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取和利用。运动性疲劳能量衰竭学说认为，运动疲劳时骨骼肌纤维葡萄糖几近耗竭、ATP生成减少，运动能力下降而不能维持预定的运动强度。造成这种结果的原因是否与骨骼肌纤维GLUT4的表达有关，相关报道尚不多见。本文通过递增负荷跑台运动建造大鼠运动性疲劳模型，测试力竭后即刻血糖、血尿素氮、血乳酸及血清胰岛素的变化，并运用RT-PCR技术和免疫组化法检测大鼠骨骼肌GLUT4基因和蛋白表达水平，旨在从分子水平上探讨机体适应性变化规律及其可能机制，为运动性疲劳外周机制研究积累有益的资料。 1.材料与方法 1.1实验动物及其饲养环境 选取8周龄健康雄性Wistar大鼠（SPF级）40只，购自甘肃中医药大学实验动物中心（合格证号：SCXK-（甘）-2011-0001），体质量175-200 g。采用国家标准啮齿类饲料喂养，自由饮食。室温23-25℃，相对湿度40%～60%，自然光照，安静无噪声。饲养室、用具等每周紫外灯照射消毒。 1.2建模及分组 所有大鼠适应环境1周后，在动物跑台（BCPT-96型，中国杭州钱江科技工贸公司）上行3 d适应性训练，淘汰体重过轻或过重及不适应跑台训练的大鼠，后随机选取10只为对照组（D）；剩余大鼠以Bedford的方法为基准，对常用的多级递增负荷跑台运动方案加以改良，以此建立大鼠运动疲劳模型：坡度为0、三级负荷：I级负荷（15 m/min，30 min），Ⅱ级负荷（20 m/min，30 min），Ⅲ级负荷（25 m/min，60 min），前6 d每天按不同等级跑一遍，第7天由Ⅲ级负荷跑至力竭（跑姿由蹬地式转为伏地式，滞留在跑道上不动，声、光、电刺激及棍棒驱赶均无效），留取建模成功大鼠20只为疲劳组（P）。 1.3取材及指标测试 力竭后即刻将每只大鼠准确称重并尾静脉取血测试尿素氮（全自动生化分析仪，兰州军区总医院安宁分院检验科）和血乳酸（便携式血乳酸仪）。后在深麻醉下（0.4%戊巴比妥钠腹腔注射）腹主动脉取血测定血糖（葡萄糖检测试剂盒，己糖激酶法）及血清（4℃下3 000 r/min离心10 min，取血清于-20℃冰箱保存）胰岛素（放射免疫分析试剂盒，购自潍坊三维生物工程集团有限公司）含量。同时迅速分离两侧股四头肌，并切取相同位置5mm3组织2块，将右侧股四头肌块置于10%甲醛溶液固定后，行常规免疫组织化学法观测细胞膜上GLUT4蛋白含量。将左侧股四头肌块置预冷生理盐水中冲洗积血多次，滤纸吸干水分。用标记好的锡纸包裹，置于液氮中冷冻过夜，然后置于-20℃低温冰箱保存，用RT-PCR法测定GLUT4mRNA表达情况。 1.4GLUT4mRNA表达的RT-PCR测定 1.4.1总RNA提取及检测 将左侧股四头肌块从液氮中取出并复温，采用UNIQlO柱式Trizol总RNA提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）并严格按要求进行操作。提取后采用紫外分光光度法、1.5%琼脂糖凝胶电泳进行纯度、浓度及完整性检测。