基因工程原理与技术-植物基因工程.pptxVIP

植物基因工程 1983年，首次获得转基因植物——转基因烟草 现在，已获得200多种植物的转基因植株。 ;第2页，共50页。;第一节 农杆菌及其转化体系 一、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciences)的生物学特征 1、形态 细胞呈杆状，大小为 0.8 um ×1.5~3.0um，1~4根周生鞭毛，菌落无色、光滑。 2、生长条件 最适温度：25~30℃，28℃培养；最适pH：6.0~9.0 3、宿主植物 双子叶植物、裸子植物 4、侵染宿主的症状及原因 冠瘿瘤，Ti质粒(tumor inducing plasmid)的T-DNA。 T-DNA是指农杆菌质粒上一段能转移并整合到植物染色体上的DNA片段。 ;二、Ti质粒的结构和功能 1、Ti质粒的类型与分区 环状双链 DNA分子， 140~235 kb。 根据其诱导植物细胞产生冠瘿碱的种类，分为章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型、农杆菌素碱型(琥珀碱型)。 ;2、T-DNA的结构与功能 边界序列：25bp，TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC 右边界序列是完全保守的，对T-DNA转移是必须的。;3、Vir区的结构与功能 30~40 kb，有virA~virM等操纵子。 virA操纵子：组成型，长约为2.8kb，virA基因。VirA蛋白(92kD)是内膜受体蛋白，感应并结合酚类化合物(乙酰丁香酮，AS)，是一种自激酶并使VirG蛋白磷酸化而被激活。 virG操纵子：组成型，1.0kb，virG基因。VirG蛋白(30kD)为转录激活因子，诱导其他vir基因的表达。 virB操纵子：诱导型，virB1~virB11基因。VirB蛋白构成跨膜复合体(T-链复合体运输器)供T-DNA越膜转移。 virC操纵子：诱导型，virC1、virC2基因。VirC1蛋白与超驱动序列(离右边界外侧17bp处的一个24bp的保守序列)结合，促进T-DNA加工。 ; virD操纵子：诱导型，virD1~virD4基因。 VirD1(16kD)、VirD2(47kD)蛋白参与T-DNA加工形成T-链：首先VirD1与25bp边界序列亲和结合，使其松弛，然后使VirD2在特异位点剪切。VirD2与T-链的5’端共价结合，并核定位信号，将T-链复合体导向细胞核。 virE操纵子：诱导型，virE1、virE2基因。VirE2蛋白(60.5kD)是ssDNA结合蛋白，与T-链结合，参与T-链复合体形成，还具有核定位信号，引导T-链复合体进入植物细胞核。 virF操纵子：诱导型，virF基因。 VirF蛋白(23kD)参与T-链复合??的运输。 virH操纵子：诱导型，virH1、virH2基因。VirH蛋白功能是降解植物伤口细胞产生的杀菌物质。 ;三、T-DNA转移至植物细胞的机理(农杆菌介导转化的机理) ①植物创伤反应与农杆菌对植物细胞的识别和附着； ②信号分子的释放积累与VirA蛋白的感应； ③VirG蛋白激活与vir基因的诱导表达； ④T-链复合体的形成； T-链是指vir基因被诱导表达后加工T-DNA而产生的单链T-DNA。 T-链复合体是指结合了VirD2、VirE2蛋白的T-链。 ⑤T-链复合体的跨膜转运； 通过T-链复合体运输器和T菌毛进入植物细胞。 ⑥T-DNA整合到植物染色体上。 ;;四、Ti质粒的改造与转化载体系统的构建 野生型Ti质粒不能直接作为植物转化载体： ①Ti质粒分子过大，没有单一的限制性内切酶位点，基因操作困难，不能直接将外源基因插入其T-DNA中； ②T-DNA区的onc基因产物将干扰受体植物内源激素的平衡，导致冠瘿瘤的产生，阻碍细胞的分化和植株的再生； 现已通过中间载体途径构建许多植物转化载体系统，主要有共整合载体系统、双元载体系统、隔端载体系统。 1、共整合载体系统(cointegrate vector system) 由卸甲Ti质粒载体、中间表达载体组成。 例如：pGV3850、 pLGVneo1103 ;Ampr;pLGVneo1103;2、双元载体系统(binary vector