酶工程微生物发酵产酶.ppt

* * * * * * * * * * 五.固定化微生物细胞发酵产酶 定义:采用各种方法固定在载体上,在一定空间范围内生长、繁殖和新陈代谢的细胞。 (一)固定化细胞产酶特点（与游离酶比较） 1.提高产酶率 2.可反复使用很长时间 3.基因工程菌质粒稳定，不易丢失 4.发酵稳定性好 5.缩短发酵周期 6.产品易分离纯化 7.适用胞外酶生产 第六十二页，共六十三页，2022年，8月28日 (二)工艺条件及控制（与游离酶基本工艺相同) 1.固定化细胞预培养 2.溶解氧供给 加大溶解氧的方法： 加大通气量 改变载体或培养基成分 3.温度控制 4.培养基组分控制 第六十三页，共六十三页，2022年，8月28日 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 调节基因 操纵基因 乳糖结构基因 P LacZ LacY Laca mRNA 阻遏蛋白（有活性） 基 因 关 闭 启动子 O R P LacZ LacY Laca 调节基因 操纵基因 乳糖结构基因 启动子 O R mRNAZ mRNAY mRNAa 阻遏蛋白（无活性） 基 因 表达 mRNA A、乳糖操纵子的结构 B、乳糖酶的诱导 乳糖 阻遏蛋白（有活性） 诱导 第三十页，共六十三页，2022年，8月28日 2.末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象： 实验： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。 第三十一页，共六十三页，2022年，8月28日 色氨酸操纵子——酶的阻遏 调节基因 操纵基因 结构基因 mRNA 酶蛋白 阻遏蛋白不能与操纵基因结合， 结构基因表达 调节基因 操纵基因 结构基因 辅阻遏物 代谢产物与阻遏蛋白结 合，使之构象发生变化 与操纵基因结合，结构基 因不能表达 第三十二页，共六十三页，2022年，8月28日 3.分解代谢物阻遏 指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。 分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。 第三十三页，共六十三页，2022年，8月28日 分解代谢物阻遏现象： 实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。 这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。 第三十四页，共六十三页，2022年，8月28日 分解代谢物阻遏 R LacZ LacY Laca mRNA mRNAZ mRNAY mRNAa 基 因 表达 CAP基因 结构基因 T CAP O CAP结合部位 RNA聚合酶 T cAMP -CAP P 葡萄糖 分解代谢产物 腺苷酸环化酶 磷酸二酯酶 ATP cAMP 5'-AMP 抑制 激活 葡萄糖降解物与cAMP的关系 cAMP CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein） 降低cAMP浓度 使CAP呈失活状态 第三十五页，共六十三页，2022年，8月28日 三、提高酶产量的策略 （一）菌种选育（一劳永逸） 1.诱变育种 (1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株 (2)使阻遏型变为去阻遏型 2. 基因工程育种 第三十六页，共六十三页，2022年，8月28日 （二）条件控制 1. 添加诱导物 酶的底物类似物最有效。 2. 降低阻遏物浓度 除去终产物 产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖 分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富 添加一定量的cAMP 第三十七页，共六十三页，2022年，8月28日 3.添加表面活性剂 离子型