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分光光度度计的详细解析 一，分光光度定义 分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范 围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。常用的波长范围为： (1)200～400nm的紫外光区(2)400～760nm的可见光区,(3)2.5～25 μm （按波数计为4000cm<-1>～400cm<-1>）的红外光区。所用仪器 为紫外分光光度计、可见光分光光度计（或比色计）、红外分光光度 计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度，所有仪器 应按照国家计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。 二，仪器组成 分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核 酸，蛋白 定量以及细菌生长浓度的定量。 仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示 与存储系统组成。 三，光谱范围 包括波长范围为400~760 nm 的可见光区和波长范围为200～400 nm 的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不 的发光体作为仪器的光源. 钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400～760nm 波长的光谱光 通过三棱镜折射后,可得到由红橙,黄绿,蓝靛,紫组成的连续色谱;该 色谱可作为可见光分光光度计的光源. 氢灯（或氘灯）的发射光谱:氢灯能发出185～400 nm 波长的光 谱可作为紫外光光度计的光源. 物质的吸收光谱(1) 如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示 的光谱已不再是光源的光谱它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某 些波长的光因溶液吸收而消失这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液 的吸收光谱. 不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶 液中所含的物质. 物质的吸收光谱(2) 当光线通过某种物质的溶液时透过的光的强度减弱.因为有一部 分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收 只有一部分光可透过溶液. 入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透过光 如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为"空白"去校正反 射,分散等因素造成的入射光的损失则: 入射光 = 吸收光 十 透过光 四，原理 分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装 置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被 吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与 样品的浓度成正比。 单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的 浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式： A=-log(I/I。)=-lgT=kLc 式中 :A 为吸光度； I。为入射的单色光强度； I 为透射的单色光强度； T 为物质的透射率； k 为摩尔吸收系数； L 为被分析物质的光程，即比色皿的边长 c 为物质的浓度 物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物 理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将 该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物 质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并 没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再 测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常 使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操 作。 五，仪器特点 1、采用高性能优质光栅，波长精度更高； 2、采用进口钨灯，发光效率高，使用寿命长，功耗降低； 3、超大规模集成，T/A转换精度高，稳定性高； 4、微机系统的应用，使操作使用简单可靠。 六，技术参数 波长范围：320∽1000nm 光谱带宽：4nm 杂散光：≤0.5% （在360nm 处） 波长准确度：优于±2nm 透射比准确度：≤±1nmT 七，常见的用途 核酸的定量 核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓 冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的 吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。 定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分 别相当于50μ g/ml