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－电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理（十二烷基硫酸钠聚丙烯 酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进， 能断裂分 子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半 胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的溶液 中，与分子按比例结合，形成带负电荷的蛋白质复合物，这种复合物 由于结合大量的，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分 子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间 天然的电荷差异，由于与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进 行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在到之 间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：，式 中：为分子量，为迁移率，、均为常数，若将已知分子量的标准蛋白 质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在 相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分 子量。 电泳成功的关键是什么？ ①溶液中单体的浓度 在水溶液中是以单体和多肽胶束的混合形式存 在，能与蛋白质分子结合的是单体。为了保证蛋白质与的充分结合， 它们的重量比应该为∶或∶。②样品缓冲液的离子强度 因为结合到 蛋白质上的量仅仅取决于平衡时单体的浓度，不是总浓度，而只有在 8 低离子强度的溶液中，单体才具有较高的平衡浓度。所以，电泳的样 品缓冲液离子强度较低，常为 。 ③二硫键是否完全被还原 只有二 硫键被完全还原以后，蛋白质分子才能被解聚，才能定量地结合到亚 基上从而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。 中的 β巯基 乙醇的浓度常为，二硫苏糖醇的浓度常为。前者有挥发性，最好使用 前加入。 缓冲液系统的选择，、、硼酸盐或者其他？ 一般来说，在被分析的蛋白质稳定的范围，凡是不与发生相互作用的 缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是 非常关键的。甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。甘氨酸系统是 目前使用最多的缓冲系统。如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用硼 酸盐缓冲系统，对于分子质量小于 的蛋白样品，可以使用尿素系统， 也可以采用缓冲系统。 积层胶（或称浓缩胶）的作用原理？ 在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在时很少解离，其有效泳动速率很 低，而氯离子却有很高的泳动速率，蛋白质的泳动速率介于两者之间。 加上电压以后，作为先导离子的氯离子和尾随离子的甘氨酸离子分离 开来，并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性和电场强 8 度成反比，这一区带便获得较高的电压梯度，加速甘氨酸离子的泳动， 使其赶上氯离子，建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速率乘积 相等的稳定态（我不太明白这句话），使这些带电颗粒以相同的速度 泳动，两种离子之间有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品 进入浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度，界面后有一高电压梯 度。由于在移动界面前的蛋白质分子泳动速率比氯离子低，因此氯离 子能迅速越过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中，其泳动 速率比甘氨酸快。因此，移动的界面将蛋白质分子堆积到一起，形成 一条狭窄的区带。蛋白质在移动界面中的浓度作用仅取决于样品和浓 缩胶中的浓度（为什么？），而与样品中蛋白质的最初浓度无关。由 于浓缩胶为大孔凝胶，故对蛋白样品没有分子筛作用。当移动的界面 到达浓缩胶和分离胶的界面时，凝胶的明显增加，导致甘氨酸大量解 离。此时，甘氨酸的有效泳动速率明显增加，超越蛋白分子，直接在 氯离子后移动。由于凝胶孔径变小，蛋白质分子的迁移速率降低，落 在后面的蛋白质便在均一的电压梯度和环境中泳动，并根据其固有的 电荷与分子大小进行分离。 电泳小问答 ：－电泳的基本原理？ ：聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进（十二烷基 硫酸钠），能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结 构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的 8 含有强还原剂的溶液中，与分子按比例结合，形成带负电荷的蛋白质 复合物，这种复合物由于结合大量的，使蛋白质丧失了原有的电荷状 态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了 各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于与蛋白质的结合是按重量 成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大 小。当分子