细胞培养技术实验报告-培养液的配置2021204198李泽.docxVIP

西北工业大学生命学院 实验报告 实 验 课 程 细胞培养技术 实 验 名 称 培养液的配置 姓 名 李泽 学 号 2021204198 班 级 21215-1 专 业 生物学 分 组 成 员 实 验 地 点 生命学院 指 导 教 师 党凯 时 间 2021.12.31  实验名称：培养液的配置 实验目的 1.掌握DMEM培养基、胰酶、干粉培养基的配制 2.学习针头滤器的使用方法 实验原理 细胞培养的基本条件 1.气体环境 气体是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生能量和合成各种成分。二氧化碳主要维持培养基的pH，并作为碳源。一般用5%的空气和5%CO2来提供动物细胞的气体生长环境。氧分压过大，不利于细胞生长。植物组织或细胞一般不需要额外提供CO2。 2.pH环境 细胞生长的pH环境为:7.2-7.4，不同细胞有所差异。一般细胞耐酸性比耐碱性大些。CO2对培养基pH的影响: CO2是细胞的代谢产物，CO2的释放必然会影响培养基的pH。 CO2 + H2O生成 H2CO3 生成H+＋HCO3- 所以，培养基中要加一些缓冲剂，以保持pH的稳定，如 NaHCO3 、 HEPES等3.糖类 葡萄糖------细胞的主要营养物质，为生命活动提供能量 糖类在生物体内的功能不仅仅是提供能量，与蛋白质和脂类共同构过程结构材料和生物活性物质。 体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基中都以葡萄糖作为能源材料，根据不同细胞的代谢特点，所加葡萄糖浓度有所不同。植物细胞培养一般以蔗糖作为能源物质。 4.氨基酸 所有细胞多需要以下12种氨基酸:精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和撷氨酸―另外所有细胞都需要谷氨酰胺，其具有特殊作用—促进氨基酸进入细胞膜，参与核酸合成，也是能源和碳源。5.维生素 在细胞代谢中起调节作用，虽然所需甚微，但为机体正常代谢不可缺少。6.促生长因子 培养基中除上述营养成分外，还需要促细胞生长因子，已知有许多激素具有促细胞增殖作用。 血清是提供促细胞生长因子和其他细胞所需物质的来源。 天然培养基与合成培养基 1.天然培养基 常用的天然培养基有血清、血浆、水解乳蛋白和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）、鼠尾胶原等。 优点:营养成分丰富，培养效果好缺点:来源受限。 成分复杂，影响某些实验产物的提取和结果的分析易发生支原体污染 2.合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如DMEM、RPMI-1640、TC199、MEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点:标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点:缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 培养基的主要种类（基础培养基）∶ 单纯的基础人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基。 完全培养基的组成 基础培养基 80%一95%血清 5%一20%碳酸氢钠 2.0 g/L青、链霉素 各100单位╱毫升 血清的功能:提供基本营养物质、提供贴壁及扩展因子、激素及各种生长因子，有一定的保护作用无血清培养基 消化液 1.胰酶溶液:0.1-0.25% ,pH一般在8左右，受Ca2+、Mg2+、血清的抑制。 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks缓冲液配制,常用的胰蛋白酶液浓度是0.25%。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间:2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 2.EDTA溶液:解离细胞，0.02%，可以和胰酶混合使用3.胶原酶溶液:用于上皮细胞的原代培养，作用于胶原， 对细胞影响很小。 4.pH调整溶液:常用的有HEPES和 NaCO35.谷氨酰氨补充溶液:最好配成100×的母液 6.抗生素溶液:常用青霉素和链霉素（双抗），配成100×的溶液。 培养基的选择: 比较不同的培养基的细胞生长曲线、生长状态、集落形成率等，选择最佳培养基建立某种细胞株的培养基，通常也是首选培养基 根据细胞的特点、实验需要，查阅文献、询问同行专家等 实验器材及试剂 烧杯，玻璃棒，研磨器，磁力搅拌器 双蒸水，DMEM粉末，DDW，FCS，D- Hanks 溶液，NaHCO3溶液，牛血清 实验步骤 (一)DMEM培养基的配制 1.三袋DMEM粉末用双蒸水溶解（先加入2/3DDW