细胞培养技术实验报告-细胞培养基本操作2021204198李泽.docxVIP

西北工业大学生命学院 实验报告 实 验 课 程 细胞培养技术 实 验 名 称 细胞培养基本操作 姓 名 李泽 学 号 2021204198 班 级 21215-1 专 业 生物学 分 组 成 员 实 验 地 点 生命学院 指 导 教 师 骞爱荣 时 间 2021.12.31  实验名称：细胞培养基本操作 实验目的 1、掌握无菌操作技术。 2、掌握原代和传代细胞培养。 3、了解细胞冷冻和复苏技术。 4、了解培养过程中不同时期细胞的形态。 实验原理 细胞培养是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等。 在所有的细胞离体培养中，最困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。 ⑴血清：动物细胞离体培养常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。 ⑵支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，塑料等作为支持物。 ⑶气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件。 将动物机体的组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶)、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 对具有移动特性的稳定细胞系或细胞株进行长期保存，一方面可以作为细胞研究的试验材料，另一方面可以做细胞制品的生产材料。目前广泛应用的细胞保存方法是低温冷冻保存法,。细胞的冷冻保存的原则是慢冻快融，这样做是为了防止细胞由于冷冻过程中产生了冰晶而发生细胞破裂。 实验器材及试剂 实验设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、电热鼓风干燥箱、冰柜、电子天平、恒温水浴槽、离心机。 一、玻璃器材 培养皿、滴流瓶、刻度吸管、离心管、培养瓶、烧杯、量筒、三角烧瓶 二、塑料器材 多孔培养板、培养皿、培养瓶 三、橡皮器材 橡皮制品做各种瓶或试管的塞子、盖子。 四、金属器材 剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头 五、其他物品 纱布、注射器和针头 药品:小牛血清、DMEM合成培养基、抗生素、DMSO冷冻剂、胰酶、PBS缓 冲液、小白鼠胚胎组织等。 实验步骤 1、消毒灭菌。 将实验所需用到的工具（如枪头、培养皿、眼科剪、镊子以及每个人的实验服等）集中灭菌、烘干。配制75%的酒精以备实验时所需。 2、培养基的配制。 分别取10ml的小牛血清、90ml 的 DMEM合成培养基，将两种培养基混合在一起，再向其中加入1ml的抗生素，吹打混匀就得到了细胞培养的培养液。3、原代培养。 (1)、准备。将实验过程中会用到的工具以及药品全部放在超净工作台上进行紫外消毒灭菌。实验开始前带好乳胶手套，用酒精对手进行消毒。 (2)、剪切与消化。将准备好的小白鼠胚胎组织放于平板中，用眼科剪将组织块剪碎，剪得越碎越好。将剪碎的组织块放于离心管中，加入大约200ul的胰酶进行消化。也可将其置于37度恒温箱中进行消化。 (3)、分离细胞。消化到一定时间时，如果离心管中的溶液中出现了明显的浑浊，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，则应该加入与胰酶等量的培养液终止消化。离心管于离心机中离心，弃上清液，得到分散的细胞。 (4)、转移细胞并培养。向含有分散细胞的离心管中加入配制好的培养液，吹打混匀，将培养液用移液器移到细胞培养瓶中。置于36.5℃恒温CO:箱培养，瓶口稍微拧松。 4、传代培养。 (1)、倒置显微镜下观察细胞的形态。倒置显微镜下观察培养细胞的长势及密度，根据细胞密度决定传代的稀释倍数。 (2)、收集原代培养的细胞。吸出培养瓶中的旧培养液，并用PBS 冲洗两遍。然后向培养瓶中加入200ul的胰酶进行消化。消化一段时间后用配置好的培养液等比例终止消化。然后离心，收集到原代培养的细胞